平凉刺五加叶生药学研究及其有效成分含量测定

2024-04-03武喜红孟钰忻高丹高博刘少博陈治郡

安徽农业科学 2024年6期

武喜红孟钰忻高丹高博刘少博陈治郡

摘要采用性状鉴别和显微鉴别法对平凉刺五加植株进行定性分析，并采用高效液相色谱法测定平凉刺五加叶中有效成分的含量。性状鉴别观察到平凉刺五加叶的形态多为椭圆状倒卵形或长圆形，基部阔楔形，边缘重锯齿，具有特殊香气。显微鉴别显示，平凉刺五加叶粉末中多含有不定式气孔、螺纹导管、草酸钙簇晶、纤维等。刺五加苷B、刺五加苷E的回归方程具有良好的线性关系，精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于5.00%。3种提取方法中微波超声协同萃取法有效成分含量最高，刺五加苷B、刺五加苷E含量分别为0.085%、0.358%；微波萃取法次之，含量分别为0.075%、0.328%；超声辅助提取法含量最低，分别为0.054%、0.222%。

关键词平凉刺五加叶；生药学鉴定；高效液相色谱法；有效成分；含量测定

中图分类号 R284 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）06-0173-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.038

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Pharmacognostic Study on the Leaves of Acanthopanax senticosus in Pingliang and the Determination of Its Active Ingredient Content

WU Xi-hong， MENG Yu-xin， GAO Dan et al

（Department of Pharmacy， Gansu Medical College， Pingliang， Gansu 744000）

Abstract Qualitative analysis of A. senticosus plants in Pingliang was conducted using trait identification and microscopic identification methods， and the content of active ingredients in the leaves of A. senticosus in Pingliang was determined using high-performance liquid chromatography.Trait identification showed that the leaves of A. senticosus in Pingliang were mostly elliptic obovate or oblong， the base was broadly wedged， the edge was heavily serrated， and the leaves had special aroma. Microscopic identification showed that the powder of A. senticosus leaves in Pingliang contained many amorphous pores， threaded conduits， calcium oxalate clusters， fibers and so on.The regression equations of eleutheroside B and eleutheroside E had a good linear relationship， and the RSD of precision， stability and repeatability tests were all less than 5.00%.Among the three extraction methods， microwave ultrasonic-assisted extraction had the highest content of active components， the content of eleutheroside B and eleutheroside E was 0.085% and 0.358%， respectively;microwave extraction method followed， with contents of 0.075% and 0.328%， respectively;the ultrasonic-assisted extraction method had the lowest content， which was 0.054% and 0.222%， respectively.

Key words Leaves of Acanthopanax senticosus in Pingliang;Pharmacognostic identification;High performance liquid chromatography;Active ingredient;Content determination

刺五加［Acanthopanax senticosus（Rupr.&Maxim.）Harms］，又名一百針、老虎潦子、刺柺棒、五加参、西伯利亚人参，多年生落叶灌木，一、二年生的通常密生刺，少见仅节上生刺或无刺，五叶相交而得名刺五加［1］。《中国药典》（2020版）记载刺五加的干燥根、根茎或茎可入药，具有益气健脾、补肾安神之效［2］，用于脾肺气虚、体虚乏力、肺肾两虚、久咳虚喘、肾虚腰膝酸痛、心脾不足、失眠多梦。其茎和果实可制作刺五加酒、饮料；种子可榨油，制作肥皂；嫩叶是时令季节一道美味的山野菜，叶片可加工成刺五加茶［3］。平凉刺五加的有效化学成分主要有黄酮类、苷类、多糖、氨基酸、维生素等［4-7］，《中国药典》（2020版）规定本品含紫丁香苷（C17H24O9）不得少于0.050%。近年来，刺五加在医学上需求量越来越大，导致野生刺五加资源过度采挖，造成野生资源严重匮乏，现在国家已将其列为三级渐危品种进行保护［8］。作为平凉当地的一种药食两用的野生资源，对其质量研究和评价很少，《平凉市“十四五”中医药发展规划》中指出，鼓励扶持刺五加（五爪子）、楤木（刺椿头）、百里香等药食两用植物的应用和开发，推进山药、百合、黄花菜等药菜两用植物的种植、加工及产业化开发，鼓励食品生产企业开发药食（菜）两用植物相关产品，提高附加产值。笔者从生药学的角度对平凉刺五加叶的质量和有效成分含量进行研究，为其应用开发提供必要的科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

岛津LC-2030C3D高效液相色谱仪（岛津有限公司）；GS-700高速粉碎机（永康市天祺盛世工贸有限公司）；SMART-DM500生物显微镜（重庆奥特光学仪器有限责任公司）；ISO9001分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；AXTD6M高速离心机（上海赵迪生物科技有限公司）；SHZ-IIIA循环水式多用真空泵（西安莫吉娜仪器制造有限公司）；UWave-2000多功能微波合成萃取仪（上海新仪微波化学科技有限公司）。

1.2 试剂

甲醇（色谱纯，天津市鑫铂特化工有限公司）；乙腈（色谱纯，天津市鑫铂特化工有限公司）；磷酸（分析纯，天津市鑫铂特化工有限公司）；刺五加苷B（纯度≥98%，购自中国食品药品检定研究院）；刺五加苷E（纯度≥98%，购自中国食品药品检定研究院）。

1.3 样品

该试验样品于2023年4月份采自平凉市崆峒区峡门沟植物全株，经鉴定为刺五加［Acanthopanaxsenticosus（Rupr.&Maxim.）Harms］。

2 方法与结果

2.1 原植物鉴定

刺五加在平凉各地均有分布，小灌木，5枚小叶，少见3枚，叶柄常疏生细小的荆棘，叶薄，纸质，椭圆状倒卵形或长圆形，先端渐尖，基部阔楔形，上部粗，暗绿色，叶脉较多，下部浅绿色，边缘具尖锐的锯齿，较小的叶柄被褐色的绒毛所覆盖。根为圆筒状，多为盘绕状，长度3.5～12.0 cm，直径0.3～1.5 cm；根的表面为灰棕色至深棕色，粗糙，具细微纵向凹痕及褶皱，表皮较薄，偶尔会脱落，脱落部分为灰黄色［7］。质地坚硬，横切面呈黄白色，呈纤维状（图1）。根茎粗1.4～4.2 cm，为节状、圆形、椭圆形。有特殊香味，略辛辣、苦涩。茎上的刺并不是固定的，一年生者刺细密发红，两年生者刺褐色，然后慢慢从茎上脱落，之后刺逐漸脱落，显环状尖刺痕迹。

2.2 性状鉴别

将采集样品晒干，浸泡在温水中，待叶片完

全舒展后，取出晾干表面水分，平置于纯色背景板上，用手机进行拍照记录并描述。药材常缠绕结团，呈淡绿色或淡褐色，展开后5～7 cm；茎细，直径0.5～1.0 mm；掌状复叶，叶互生，具叶柄，叶片卵形，长4～5 cm，宽2～3 cm，上表面多为深绿色（图2a），下表面为淡绿色（图2b），先端急尖或渐尖，基部楔形，具有淡黄绿色的叉状叶脉，叶柄0.8～1.5 cm，基部呈抱茎鞘（图2c）。

2.3 粉末鉴别

取干燥叶粉碎，过3号筛，取少量置载玻片上，滴加水合氯醛，加热透化，置显微镜下观察，结果发现（图3～4），导管多为螺纹导管，直径8～24 μm；可见不定式气孔，副卫细胞3～4个；草酸钙簇晶较多，呈黄棕色，棱角较钝［9-10］。

2.4 刺五加叶有效成分含量提取

2.4.1

HPLC方法建立。选择C18反相色谱柱；以乙腈-0.1％磷酸水溶液（20∶80）为流动相，选择乙腈作为流动相，因为同条件下乙腈-水的分离效果优于甲醇-水的分离效果，加入一定量的酸性溶液是因为其可以有效改善峰型，防止拖尾。柱温设置为30 ℃，色谱流速为1.0 mL/min，刺五加苷B紫外最大吸收峰为265 nm，所以在265 nm处检测刺五加苷B，同理刺五加苷E在210 nm处进行检测［11-13］。

2.4.2 标准溶液的制备。分别精密称取20.00 mg的刺五加苷B、刺五加苷E的对照品，使用50%色谱甲醇，对其进行溶解，并最终置于10 mL容量瓶内定容，得到浓度为2 mg/mL的标准品储备溶液。之后使用50%色谱甲醇将标准品储备液稀释成所需浓度梯度的标准溶液，并通过0.45 μm有机滤膜过滤，制备好标准品后将其置于冰箱中冷藏备用［14］。

2.4.3 供试品溶液的制备。

（1）微波萃取法。将采集到的刺五加叶晒干后置于高速粉碎机中充分粉碎，过40目筛，样品保存在阴凉通风处，备用。精密称取刺五加叶粉末5.086 0 g置于250 mL微波萃取器中，加入100 mL甲醇，放置于微波萃取仪中进行提取，微波萃取功率设置为250 W，温度设置为60 ℃，时间15 min。

萃取结束后进行抽滤，抽滤后，取部分滤液置于离心管中，放入离心机，6 000 r/min离心15 min。最后取上清液，使用微孔滤膜（0.45 μm）过滤所得溶液，得到样品溶液，置于4 ℃冰箱保存，备用。

（2）超声辅助提取法。精密称取刺五加叶粉末5.015 8 g置于250 mL微波萃取器中，加入100 mL甲醇，将锥形瓶放置于微波萃取仪中进行超声提取，超声功率设置为400 W，温度同样设置为60 ℃，时间15 min。提取结束后进行抽滤，取部分滤液置于离心管中，放入离心机，6 000 r/min 离心15 min。最后取上清液，使用微孔滤膜（0.45 μm）过滤所得溶液，得到样品溶液，置于4 ℃冰箱保存，备用。

（3）微波超声协同萃取法。精密称取刺五加叶粉末5.004 6 g置于250 mL微波萃取器中，加入100 mL甲醇，放置于微波萃取仪中微波超声协同萃取，提取功率设置为250 W，提取温度为60 ℃，超声功率400 W，时间15 min。提取结束后进行抽滤，取部分滤液置于离心管中，放入离心机，6 000 r/min 离心15 min。最后取上清液，使用微孔滤膜（0.45 μm）过滤所得溶液，得到样品溶液，置于4 ℃冰箱保存，备用。

2.4.4

刺五加苷B、刺五加苷E的含量测定。按照“2.4.3”方法完成刺五加叶中有效成分提取，然后利用“2.4.1”所建立的HPLC多组分检测方法完成对刺五加苷B、刺五加苷E定性定量测定分析。刺五加苷B、刺五加苷E对照品和供试品色谱图见图5～6。观察图谱，比较各对照品保留时间发现，此

法专属性强。

选择微波萃取法、超声辅助提取法和微波超声协同萃取法对平凉刺五加叶中刺五加苷B、刺五加苷E进行提取，其含量如表2所示。从表2可以看出，微波超声协同萃取法有效成分含量最高，微波萃取法次之，超声辅助提取法含量最低。

2.4.5 方法学验证。

2.4.5.1 重现性。将刺五加苷B、刺五加苷E这2种对照品溶液重复进样6次，记录每种被分析物的色谱峰面积和液相保留时间，并计算其相对标准偏差（RSD），结果如表3所示。从表3可以看出，刺五加苷B、刺五加苷E峰面积的RSD分别为5.137%、3.261%，刺五加苷B、刺五加苷E保留时间的RSD分别为0.81%、0.61%，表明该试验所建立的分析方法重现性良好。

2.4.5.2

精密度。该试验选择日间精密度检测，日间精密度指的是在24 h内将每个待分析的样品重复进样6次，并最终计算每种分析物的峰面积和保留时间的RSD。通过计算得出刺五加苷B、刺五加苷E的日间精密度分别为4.42%、3.89%，均小于5.00%，表明该分析方法具有良好的精密度。

2.4.5.3

稳定性。在“2.4.1”色谱条件下，取已经提取好的样品溶液，在12、14、16、18、20、22 h各进样1次，测定刺五加苷B、刺五加苷E峰面积，计算刺五加苷B、刺五加苷E的RSD分别为4.67%、4.89%，均小于5.00%，表明供试品溶液在22 h内稳定。

2.4.5.4

标准曲线的绘制。使用分析天平精密量取刺五加苷B、刺五加苷E对照品，用色谱甲醇配制成50%的甲醇溶液，备用。用50%的甲醇将储备溶液稀释成一系列浓度梯度的对照品测试溶液，依次通过高效液相色谱对其进行检测，每个测试浓度都重复3次试验，并记录相应数据，最终以刺五加苷B、刺五加苷E对照品的浓度作为横坐标、峰面积作为纵坐标绘制对照品的标准曲线（图7），得出其线性回归方程（表4）。刺五加苷B、刺五加苷E线性回归方程的R2均大于0.998，表明对于2种目标分析物的回归方程具有良好的线性关系。以上试验结果充分表明该试验所建立的对于刺五加苷B、刺五加苷E的分析方法准确率较高。

3 结论

该研究以平凉刺五加为研究对象，对该植株进行生药学的性状和显微鉴别，该植株叶片多为椭圆状倒卵形或长圆形，先端渐尖，基部阔楔形，边缘具尖锐的锯齿，叶上面粗糙、深绿色，叶脉多，下面淡绿色；小叶柄有棕色短柔毛，叶具有特殊香气。显微鉴别观察到刺五加叶粉末中含有不定式气孔，导管多为螺纹状、草酸钙簇晶但棱角较钝，含有较多纤维等。选择微波萃取法、超声辅助提取法和微波超声协同萃取法进行刺五加苷B、刺五加苷E提取，微波超声协同萃取法有效成分含量最高，利用高效液相色谱法测定平凉刺五加叶中刺五加苷B、刺五加苷E含量分别为0.085%、0.358%；微波萃取法次之，含量分别为0.075%、0.328%；超声辅助提取法含量最低，分别为0.054%、0.222%。

该试验借鉴其他文献的检测方法，并在其检测方法基础上进行了一定的优化，最终所建立的高效液相色谱分析方法可以检测刺五加叶中的2种苷类有效成分。该方法稳定性强、精密度高、重现性好，适合于刺五加叶中刺五加苷B、刺五加苷E这2种目标化合物的定性定量分析检测，研究结果可为当地产刺五加的资源开发利用提供一定的科学理论依据。

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