低温环境下野外自然好氧堆肥理化特征及微生物群落结构变化

曾桥 施春阳 李俊 李祥 张璐璐

摘要 ［目的］研究低温环境下野外自然好氧堆肥理化特征及微生物群落结构变化，实现低温季节养殖废弃物的资源化利用。［方法］以猪粪和稻壳为原料在低温环境下进行自然好氧堆肥处理，对堆肥过程中温度、pH、含水率、NH+4-N、NO-3-N和种子发芽指数（GI）进行分析，选取细菌16S rDNA V3～V4区和真菌ITS序列进行高通量测序，比较好氧堆肥过程中不同阶段微生物群落多样性及组成差异。［结果］当环境温度为-6.7～6.4 ℃时，整个堆肥过程高温阶段持续11 d，经过38 d的好氧堆肥处理，堆体含水率、pH、NH+4-N、NO-3-N等指标均趋于稳定，堆肥结束时GI达到了122.12%，表明堆肥产品完全腐熟。低温条件下堆肥不同阶段样本微生物群落分析表明，Acinetobacter是堆肥初期和升温阶段优势细菌属，而Pseudofulvimonas和Ensifer在堆肥高温阶段丰度最高，Parapedobacter为堆肥末期优势细菌属。Ascobolus是堆肥初期优势真菌属，而Mycothermus为好氧堆肥升温、高温和腐熟阶段的优势菌群。细菌群落功能预测结果表明，氨基酸转运和代谢、碳水化合物運输和代谢等是堆肥过程中细菌的主要代谢功能。理化指标与微生物多样性相关性分析表明，堆肥过程中pH与属水平上丰度较高的微生物相关性强，含水率、温度、NH+4-N和发芽指数次之。［结论］低温条件下野外自然好氧堆肥可顺利进行并完全腐熟，这为低温环境下野外自然好氧堆肥提供了依据。

关键词 好氧堆肥；低温环境；理化特征；高通量测序；群落结构；功能预测

中图分类号 X713  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）06-0051-09

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.013

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Changes of Physico-chemical Characteristics and Microbial Community Structure During Natural Aerobic Composting Under Low Temperature Environment in the Field

ZENG Qiao1，2， SHI Chun-yang1，2， LI Jun3 et al

（1.School of Food and Biological Engineering，Shaanxi University of Science&Technology，Xian，Shaanxi 710021;2.Shaanxi Research Institute of Agricultural Products Processing Technology， Xian，Shaanxi 710021;3.Xian Agricultural Technology Extension Center，Xian，Shaanxi 710061）

Abstract ［Objective］To study the changes of physico-chemical characteristics and microbial community structure during natural aerobic composting under low temperature in the field，realize the resource utilization of breeding waste in low temperature season.［Method］Using pig manure and rice husk as raw materials for aerobic composting in the field， the temperature， pH， water content， NH+4-N， NO-3-N and germination index （GI） of seeds during composting process were analyzed， the bacterial 16S rDNA V3-V4 region and fungal ITS region were further selected for high-throughput sequencing.The diversity and composition of microbial communities in different stages of aerobic composting process were compared.［Result］When the environmental temperature was -6.7-6.4 ℃， the high-temperature stage of the entire composting process lasted for 11 days. After 38 days of aerobic composting treatment，the moisture content， pH， NH+4-N， NO-3-N and other indicators of the pile tended to be stable. At the end of composting， the GI reached 122.12%， indicating that the compost product was completely decomposed.The analysis of microbial communities in samples from different stages of composting under low temperature conditions showed that Acinetobacter was the dominant bacterial genus in the early and heating stages of composting， Pseudofulvimonas and Ensifer had the highest abundance in the high temperature stage of composting， and Parapedactor was the dominant bacterial genus in the late stage of composting. Ascobolus was the dominant fungal genus in the early stages of composting， while Mycothermus was the dominant microbial community in the heating， high temperature and maturation stages of aerobic composting.The predicted results of bacterial community function showed that amino acid transport and metabolism，carbohydrate transport and metabolism et al were the main metabolic functions of bacteria in composting process.The correlation analysis between physicochemical indexes and microbial diversity showed that the pH and genus abundance were highly correlated， followed by water content， temperature， NH+4-N and GI.［Conclusion］Natural aerobic compost can be carried out smoothly and completely decomposed in the field under low temperature conditions，it provide a basi for natural aerobic composting in the field under low temperature environment.

Key words Aerobic composting;Low temperature;Physico-chemical characteristics;High-throughput sequencing;Community structure;Function prediction

近年来，随着我国人民生活水平的提高，对肉蛋奶等畜禽产品的需求量不断增长，畜禽养殖业朝着集约化、工厂化、规模化方向迅速发展，从而导致畜禽粪便的排放量不断增加。我国是世界上最大的畜禽养殖国，每年产生的畜禽粪便废弃物高达40亿t［1］，而规模化养殖场中有90%以上都缺乏必要的粪污治理措施，农村也存在大量未经处理的畜禽粪便被随意处置和排放的现象，这不仅浪费了大量的养分资源，而且给环境带来了极大的压力。

好氧堆肥处理是实现畜禽粪便无害化和资源化利用的一个重要途径，经过好氧堆肥处理，其发酵产物施用于土壤不仅可以增加土壤肥力，提高土壤保水、透气的能力，还可以调节土壤中微生物菌群种类和数量，从而改善土壤结构，推进农业提质增效，同时避免了畜禽粪便低质量处理所导致的环境问题。野外自然好氧堆肥堆体适中，易于操作，不需要额外添加菌剂，适用于农村较为分散的农户对在畜禽养殖和农业生产过程中产生的废弃物进行资源化利用。环境温度对好氧堆肥进程有较大的影响，环境温度高，堆肥过程启动快，堆肥效率也较高。我国地域辽阔，北方地区冬季时间长，温度低，但是有关低温环境下的野外自然好氧堆肥研究报道较少。

好氧堆肥的实质是利用微生物的生长和代谢活动转化畜禽粪便中的有机物为无机物和稳定的腐殖质的过程［2］，微生物群落的代谢能力和菌群结构是影响好氧堆肥效果的关键因素［3］。堆肥过程中参与的微生物数量庞大，种类繁多，作用复杂，由于绝大部分微生物难以实现纯培养，因此，无法采用传统方法对其进行分离和鉴定。近年来，高通量测序技术被广泛应用于堆肥环境中微生物多样性分析，该技术可检测到样本中传统纯培养不能发现的低丰度微生物菌群，有助于更加全面准确地揭示环境中微生物群落的复杂度和多样性［4］。该研究选取猪粪和稻壳作为堆肥原料，在冬季低温条件下采用好氧堆肥工艺，研究野外堆肥过程中主要理化参数的动态变化，并对堆肥过程中微生物群落变化进行分析，从而深入了解低温环境下堆肥过程中微生物群落的变化规律，为开发适宜农村分散的小堆体畜禽粪便冬季自然好氧堆肥化利用提供依据，从而促进畜禽粪便的资源化利用。

1 材料与方法

1.1 材料来源

新鲜猪粪取自兴平市星光良种猪繁养殖有限公司，稻壳购自湖北京和米业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 好氧堆肥试验设计。

试验在冬季进行，环境温度为-6.7～6.4 ℃，试验地点为陕西西安。

将稻壳粉碎，过12目筛，按一定比例与新鲜猪粪混合均匀，调节碳氮比为30左右，调节堆体含水量为60%左右，堆体为圆锥体。每3 d翻堆1次，进入降温阶段后，每7 d翻堆1次，进入腐熟期停止翻堆，整个堆肥周期为38 d。

1.2.2 采样方法。

从堆制0 d起，每2 d于堆体内部分别距离底部30 cm处和距离外部15～30 cm处的截面上多点共取混合样品500 g（鲜重），样品混匀后，采用四分法取样，样品分为两份，一份用于测定理化指标，另一份贮存于-20 ℃冰箱备用。同时，于堆肥的0、4、10、16、38 d分别取样，编号依次为1、2、3、4、5，贮存于-80 ℃冰箱用于高通量测序。

1.2.3 理化指标分析。

采用自动温度记录仪测定堆体温度，将温度记录仪探头插入堆体距离底部30 cm处和距离外部15～30 cm处的截面上随机排布5个点，取平均温度作为堆体实际温度。取适量样品于105 ℃下干燥至恒重，计算含水率。pH采用pH计测定。

硝态氮（NO-3-N）按NY/T 1116—2014规定的方法测定。

铵态氮（NH+4-N）采用靛酚蓝比色法测定［5］。

种子发芽指数：取新鲜堆肥样品3 g加入30 mL去离子水中，置于水平搖床上振荡2 h后过滤，吸取滤液5 mL，加到铺有滤纸的9 cm培养皿中。每个培养皿内点播20粒颗粒饱满的小白菜种子，置于培养箱中于28 ℃培养，避光培养3 d，以去离子水作对照，按下式计算发芽指数［6］：

GI=（A×B）/（C×D）×100%（1）

式中：A为堆肥浸提液种子发芽率；B为堆肥浸提液种子根长；C为蒸馏水种子发芽率；D为蒸馏水种子根长。

1.2.4 微生物群落结构分析。

1.2.4.1 DNA的提取。

样品DNA采用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit试剂盒（OMEGA，美国）按操作流程进行提取。

1.2.4.2 16S rDNA和ITS序列高通量测序。

采用特异性引物341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）、805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）对细菌16S rDNA 基因的V3～V4可变区进行PCR扩增。采用特异性引物ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）、ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）对真菌ITS rDNA基因的ITS1～ITS2区进行PCR扩增。PCR初次扩增条件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，5个循环；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，20个循环；72 ℃ 5 min。PCR二次扩增条件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，5个循环；72 ℃ 5 min。进一步对DNA进行纯化，利用Qubit3.0 DNA 检测试剂盒对回收的DNA 精确定量，等量混合后送生工生物工程（上海）股份有限公司基于Illumina平台进行高通量测序分析。

1.3 数据分析

理化指标测定相关试验均重复3次，试验结果均采用Graph Pad Prism软件进行处理。高通量测序序列结果采用QIIME进行分析。序列质控过程将碱基平均质量低于20以及片段长度低于200 bp 的序列删除［7］，同时，将含有模糊碱基的序列也進行删除。采用“join paired ends.py”命令对两端测序序列进行拼接。采用USEARCH61（Edgar 2010）比对 SILVA和UNITE数据库进行嵌合体去除［8-9］。对去噪后序列采用QIIME进行多样性分析，在97%的水平上进行分类操作单元（OTU）聚类［10］，并分别与SILVA和UNITE进行比对，确定微生物的分类信息。基于Weighted UniFrac采用“beta diversity through plots.py”在QIIME中进行主成分分析（PCA）。

2 结果与分析

2.1 好氧堆肥过程中温度的变化

从图1可以看出，整个堆肥过程环境温度为-6.7～6.4 ℃，堆体温度在6 d时达到50.7 ℃，在10 d时达到峰值54.3 ℃，至15 d开始，堆体温度逐步下降，至17 d时，堆体温度下降至50 ℃以下，且下降较快；从25 d起，堆体温度下降缓慢，并逐步稳定。整个堆肥过程由于温度的不同明显分为3个阶段，0～5 d为升温阶段，6～16 d为高温阶段，17～38 d为降温腐熟阶段。该试验堆肥初期堆体升温较慢，且堆体最高温度较相关报道［11］的温度低，可能的原因包括一方面此次堆肥试验在冬季进行，环境温度较低，进而造成堆体温度也较低；另一方面，该试验为自然堆肥，未添加外源菌剂，因此启动较慢。从图1可以发现，整个堆肥过程中，堆体温度在50 ℃以上维持了11 d，符合国家《粪便无害化卫生要求》（GB 7959—2012）规定，达到了畜禽粪便无害化处理的要求，说明自然好氧堆肥在冬季较低环境温度下可以顺利进行。

2.2 好氧堆肥过程中含水率和pH的变化

有文献报道，合适的堆肥初始含水率为50%～60%［12］。水分对于堆肥过程中微生物的生长繁殖过程必不可少，一方面，堆肥物料中的营养成分溶解于水中被微生物生长和代谢所利用，另一方面，堆肥过程中由于微生物的作用，堆体温度逐步升高，水分的蒸发有利于调节堆体温度，从而保证堆肥进程的顺利进行。由图2可知，堆肥初始含水率为58.69%，随着堆肥过程的进行，含水率逐步降低，至20 d，含水率降至47.27%；从22 d 起，含水率下降速率大大降低，至38 d，含水率为43.90%，整个过程堆肥含水率下降了14.79百分点。该试验含水率下降较慢，且堆肥结束时产品含水率也较高，这与张蕴琦等［13］采用牛粪和水稻秸秆在低温下进行好氧堆肥的研究结果一致，主要是由于堆肥过程在冬季进行，环境温度较低，因此，堆体水分蒸发较慢，从而导致产品含水率较高。好氧堆肥过程中pH从初始的7.02逐步上升至8.10，从6 d起，pH逐步下降，至16 d，pH逐步稳定，至堆肥结束时，pH为7.86。在堆肥前期，堆体pH迅速上升，这可能是由于堆体温度上升，大量有机质被分解产生了大量NH+4-N；而随着堆肥的进行，堆肥过程中产生的NH3大量挥发，以及微生物发酵产生了有机酸，从而使得堆体pH略下降，至堆肥结束，堆体逐步稳定，pH也趋于稳定。总体来看，冬季低温环境下堆肥pH变化较其他季节温和，这是由于在气温相对较高的季节微生物繁殖旺盛，堆肥过程相对剧烈。

2.3 好氧堆肥过程中NO-3-N、NH+4-N的变化

从图3可以看出，NH+4-N含量从堆肥开始明显上升，至4 d达到最大值，总体来说，NH+4-N含量呈先上升后下降的趋势，这是由于随着堆肥的进行，温度逐渐升高，微生物活动加剧，同时由于矿化作用，因而产生了大量的NH+4-N。然而进入高温阶段后，由于温度的升高以及翻堆，促使NH+4-N以NH3释放出来，从而造成NH+4-N含量的下降。与图1对比可以发现，NH+4-N含量的最高点在堆肥进入高温阶段前出现，这说明相关微生物在堆肥升温阶段已经开始大量生长和代谢，并通过脱氨作用将NH3释放，从而使得NH+4-N上升。NO-3-N变化趋势与NH+4-N完全相反，堆肥初期，NO-3-N含量先下降，而后逐渐上升，至20 d，NO-3-N含量达到峰值，此后NO-3-N含量缓慢下降并逐步保持稳定。堆肥过程中NO-3-N含量的变化与硝化细菌的活性密切相关［14］，高温对硝化细菌的活性有一定的抑制作用，因此，NO-3-N含量的峰值较堆肥高温阶段滞后。至堆肥结束，NO-3-N和NH+4-N含量比值接近1，说明在低温环境下进行的好氧堆肥已经达到腐熟。

2.4 好氧堆肥过程中发芽指数的变化

堆肥腐熟度是评价堆肥质量的重要指标，未腐熟的堆肥含有大量对植物种子有毒害作用的小分子有机物、NH3、挥发性脂肪酸和酚酸等［15］，从而抑制种子的生长。发芽指数是通过检验堆肥浸提液对植物种子发芽是否产生抑制作用来评价堆肥无害化、稳定化程度的指标，但是目前对于种子发芽指数达到多少表明堆肥已经腐熟，目前还尚需进一步研究确定。有研究认为，种子发芽指数大于50%则可以认为堆肥已达腐熟［16］，一般达到80%时，可认为堆肥已经完全腐熟［17］，也有学者认为，发芽指数达到110%是评价堆肥腐熟的较为合适的指标［18］。从图4可以看出，在堆肥结束的38 d，种子发芽指数达到了122.12%。此外，NO-3-N/NH+4-N接近1，同时温度、含水率、pH等指标均趋于稳定，可以判断低温环境下的野外自然堆肥产品完全腐熟，这为冬季低温环境下堆肥提供了依据。

2.5 低温环境下堆肥微生物群落组成分析

2.5.1 堆肥不同阶段样本α多样性分析。

α多样性可以反映微生物群落的丰度和多样性，Chao指数和Ace指数越大，说明微生物群落丰富度越高；Shannon指数越大，说明群落多样性越高；Simpson指数越大，说明群落多样性越低；Coverage指数实际反映了测序结果是否代表样本的真实情况，其数值越高，则样本中序列没有被测出的概率越低［19］。堆肥各阶段样品细菌和真菌群落α多样性分析结果见图5，从图5可以看出，Coverage指数均在0.93以上，说明测序结果能较真实地反映样品中微生物群落［20］；由Chao指数和Ace指数可知，细菌和真菌群落丰富度变化趋势一致，均呈下降—上升—下降—上升。由Shannon指数可知，细菌群落多样性在升温和高温阶段呈逐步上升趋势，高温阶段末期和腐熟阶段呈下降趋势；而真菌群落多样性在升温阶段先上升，至高温阶段下降，在高温末期则又上升，腐熟阶段多样性下降。α多样性分析表明，猪粪堆肥样品的微生物多样性初期和升温阶段是最丰富的，而田伟［18］以牛粪为原料堆肥时，腐熟后的堆肥样品中的微生物多样性最丰富，说明不同的氮源对微生物多样性有较大影响。

2.5.2 堆肥过程中微生物群落结构。

2.5.2.1 细菌群落结构。

从图6可以看出，Acinetobacter是堆肥初期优势细菌属，其丰度为65.91%，其次丰度较高的细菌属为Pseudomonas、Psychrobacter、Devosia、Brevundimonas、Comamonas，其丰度为1.19%～9.74%。随着堆肥的进行，堆体温度逐渐升高，在升温阶段，Acinetobacter丰度下降至33.2%，但仍为丰度最高的细菌属，Devosia、Leadbetterella、Pseudomonas、Brevundimonas、Stenotrophomonas、Comamonas、Gemmobacter等为丰度次之的细菌属，其丰度为1.65%～8.40%。随着堆肥进入高温阶段，Acinetobacter的丰度迅速下降至1.54%，Pseudofulvimonas丰度最高，达19.95%，Ensifer丰度次之，为4.25%，Verrucomicrobium的丰度为3.76%，其余丰度较高的细菌属为Devosia、Luteimonas、Pseudoxanthomonas、Parapedobacter、Solibacillus、Kofleria、Povalibacter等，其丰度为1.84%～2.88%。高温阶段末期，Pseudofulvimonas、Ensifer、Parapedobacter、Gp6、Luteimonas丰度均略有升高，累計丰度达37.47%；Verrucomicrobium丰度略有下降，为2.38%；Bordetella、Devosia、Povalibacter、Pseudoxanthomonas的丰度为1.76%～2.27%；Parapedobacter为堆肥末期优势细菌属，丰度为12.37%，Pseudofulvimonas、Pseudomonas、Luteimonas、Rhodanobacter、Phaselicystis、Arachidicoccus、Ensifer等丰度为1.69%～3.43%。

从图6b可以发现，整个好氧堆肥过程中，总体丰度较高的细菌属分别为Acinetobacter、Pseudofulvimonas、Parapedobacter、Pseudomonas、Devosia、Ensifer、Luteimonas、Verrucomicrobium和Gp6等，它们是堆肥过程中主要的细菌属。Acinetobacter主导升温阶段，Pseudofulvimonas主导高温阶段和降温阶段，Parapedobacter主导腐熟阶段。

2.5.2.2 真菌群落组成。

从图7a可以看出堆肥过程中真菌群落在属水平上的分布，Ascobolus是堆肥初期优势真菌属，其丰度为18.53%，其次为Verticillium，丰度为6.65%，其余丰度在1.00%以上的真菌属包括Alternaria、Papiliotrema。在堆肥升温阶段，真菌群落结构发生了较为明显的变化，Ascobolus丰度下降很快，下降幅度达84%，但仍然为升温阶段丰度较高的真菌属，其余丰度较高的包括Arthrographis、Fusarium、Anthopsis、Cystofilobasidium、Cryptococcus、Alternaria等，其丰度为0.36%～2.02%。随着堆肥过程的进行，Mycothermus成为好氧堆肥高温阶段的绝对优势菌群，其丰度为72.75%，Anthopsis丰度略高于升温阶段，达到3.48%，其余丰度较高的分别为Candida、Aspergillus、Verticillium、Ascobolus、Mortierella等，丰度为0.32%～0.80%。高温阶段后期，Mycothermus丰度略有下降，但仍然为优势菌群，Anthopsis丰度上升至4.94%，Verticillium、Candida、Aspergillus、Alternaria、Archaeorhizomyces、Mortierella、Ascobolus等丰度为0.46%～1.66%。在堆肥腐熟阶段，Mycothermus丰度进一步下降，但仍然为优势菌群，至好氧堆肥末期，其丰度下降至45.10%；Mortierella丰度上升较快至3.80%，Chrysosporium、Myceliophthora、Verticillium、Aspergillus等丰度为0.39%～0.72%。

从图7b可以发现，好氧堆肥过程中，总体丰度较高的真菌属为Mycothermus、Ascobolus、Anthopsis、Verticillium、Mortierella等，其中Ascobolus是堆肥初期和升温阶段主导真菌属，Mycothermus主导高温阶段、降温和腐熟阶段。

2.5.3 堆肥不同阶段样本PCA和OTU分析。

基于细菌门水平相对丰度PCA分析结果（图8a）表明，PCA1和PCA2的主要贡献之和为90%，表明在这2个维度上能够反映样本的实际情况。从图8a可以看出，在堆肥过程中细菌群落结构发生了明显的变化，不同阶段样本发生了明显的分离，其中样本3和样本4距离较近，说明菌群结构相似。这可能是由于样本3和样本4分别为堆肥第10天和第16天，堆体温度差异不大，因而菌群结构也较相似，随着堆肥逐步进入腐熟阶段，堆体温度下降较快，细菌群落结构变化也较大。利用Venn图研究不同阶段样品中细菌分布的变化，结果如图8b所示，5个样本中共检出16 511个OTUs，其中仅114个OTUs是共有的，占总OTUs数目的0.69%。其中，堆肥初期样本中特有OTUs数目为3 103个，占总OTUs数目的18.79%；升温阶段样本中特有OTUs数目为3 183个，占总OTUs数目的19.28%；高温期和高温末期特有的OTUs数目分别为2 898和2 642个，分别占总OTUs数目的17.55%和16.00%；堆肥末期样本中特有OTUs数目为3 679个，占总OTUs数目的22.28%。堆肥各不同阶段样本中特有OTUs数目总计15 505个，共占总OTUs数目的93.90%。该结果表明，在低温环境下好氧堆肥不同阶段细菌群落结构发生了明显的变化。

基于真菌门水平相对丰度PCA分析结果（图9a）表明，PCA1和PCA2的主要贡献之和为88%，表明在这2个维度上能够反映样本的实际情况。从图9a可以看出，在堆肥过程中真菌群落结构发生了明显的变化，不同阶段样本发生了明显的分离，其中样本3和样本4距离较近，说明菌群结构相似。这可能是由于样本3和样本4分别为堆肥第10天和第16天，堆体温度差异不大，因而菌群结构也较相似，随着堆肥逐步进入腐熟阶段，堆体温度下降较快真菌群落结构变化也较大。利用Venn图研究不同阶段样品中真菌分布的变化，结果如图9b所示，5个样本中共检出3 498个OTUs，其中26个OTUs是共有的，占总OTUs数目的0.74%，堆肥初期、升温阶段、高温期、高温末期、堆肥末期样本中特有OTUs数目分别为584、436、691、603和734个，共占总OTUs数目的87.14%。该结果表明，在低温环境下好氧堆肥不同阶段真菌群落结构发生了明显的变化。

2.5.4 堆肥过程中细菌群落功能变化。

从图10可以看出，在好氧堆肥初期，细菌菌群对应的主要功能为氨基酸转运和代谢（amino acid transport and metabolism），转录（transcription），能量产生与转化（energy production and conversion），翻译、核糖体结构和合成（translation，ribosomal structure and biogenesis），细胞壁、细胞膜和细胞壳的合成（Cell wall/membrane/envelope biogenesis），无机离子转运和代谢（inorganic ion transport and metabolism）等。而在升温阶段，主要功能为氨基酸转运和代谢，转录，能量产生与转化，碳水化合物运输和代谢（carbohydrate transport and metabolism），细胞壁、细胞膜和细胞壳的合成，无机离子代谢，信号传导机制（singal transduction mechanisms），翻译、核糖体结构和合成等。高温和降温阶段，细菌菌群主要代谢功能与升温阶段类似。总体来看，氨基酸转运和代谢、碳水化合物运输和代谢等是堆肥过程中细菌的主要代谢功能，堆肥原料中丰富的纤维素、蛋白质、脂肪等通过氨基酸转运和代谢、碳水化合物运输和代谢所产生的氨基酸、大分子糖类、多酚、多肽等是腐殖酸合成的前体物质，具有促进腐殖酸合成和提高腐殖酸产量及分子量的作用，从而加快堆肥进程和促进堆肥的腐熟［21-22］。

2.6 微生物多样性与理化指标相关性分析

将堆肥过程中理化指标与丰度较高的细菌属和真菌属进行相关性分析，结果如表1所示。pH与Acinetobacter、Pseudomonas、Luteimonas、Pseudoxanthomonas、Ascobolus、Verticillium、Anthopsis高度相关（|r|>0.8），且与Acinetobacter、Ascobolus和Verticillium呈显著负相关（P<0.05），与Luteimonas呈显著正相关（P<0.05）；含水率与Acinetobacter、Pseudofulvimonas、Pseudoxanthomonas、Parapedobacter、Povalibacter、Verticillium、Anthopsis、Mycothermus高度相关（|r|>0.8），其中与Anthopsis呈顯著负相关（P<005）；温度与Acinetobacter、Pseudofulvimonas、Pseudoxanthomonas、Parapedobacter、Povalibacter、Mycothermus高度相关（|r|>0.8），与Parapedobacter呈显著负相关（P<0.05），与Mycothermus则呈显著正相关（P<0.05）；NH+4-N与Pseudofulvimonas、Pseudoxanthomonas、Parapedobacter、Povalibacter、Verticillium、Anthopsis、Mycothermus高度相关（|r|>0.8），与Pseudoxanthomonas呈极显著正相关（P<0.01），与Anthopsis呈显著负相关（P<0.05）；NO-3-N除与Pseudoxanthomonas高度相关外，与其他属微生物相关性较弱；发芽指数与Acinetobacter、Pseudofulvimonas、Pseudoxanthomonas、Parapedobacter、Povalibacter、Anthopsis、Mycothermus高度相关（|r|>0.8），与Anthopsis呈显著正相关（P<0.05）。

3 结论

（1）低温环境下野外自然好氧堆肥启动慢，高温阶段温度相对较低，但经过38 d好氧堆肥过程，堆体各项理化特征指标趋于稳定，种子发芽指数达到了122.12%，说明低温环境下堆肥样品可以达到腐熟。

（2）堆肥升温阶段细菌和真菌多样性较为丰富，细菌和真菌多样性变化存在一定差异。堆肥过程中微生物群落结构发生了明显变化，细菌属水平上优势菌群随着堆肥过程的进行而发生改变，但真菌属水平上优势菌群在进入高温阶段后至堆肥结束主要为Mycothermus。氨基酸转运和代谢、碳水化合物运输和代谢等是堆肥过程中细菌的主要代谢功能，它们加快了堆肥的进程和促进了堆肥的腐熟。

（3）理化指标与微生物多样性相关性分析表明，堆体pH、含水率、温度、NH+4-N和发芽指数等因素与多种属水平上丰度较高的微生物存在显著相关性（P<0.05），而NO-3-N与属水平上主要菌群相关性均不显著（P>0.05）。

参考文献

［1］ 阎波杰，赵春江，潘瑜春，等.大兴区农用地畜禽粪便氮负荷估算及污染风险评价［J］.环境科学，2010，31（2）：437-443.

［2］ 刘立，张朝升，赵美花.生物炭对好氧堆肥化处理影响的研究进展［J］.环境科学与技术，2018，41（9）：170-175，182.

［3］ 王秀红，李欣欣，史向远，等.好氧堆肥微生物代谢多样性及其细菌群落结构［J］.环境科学研究，2018，31（8）：1457-1463.

［4］ 牛世全，龙洋，李海云，等.应用Illumina MiSeq 高通量测序技术分析河西走廊地区盐碱土壤微生物多样性［J］.微生物学通报，2017，44（9）：2067-2078.

［5］ 郭文淼，辛宇，张金尧，等.全波长扫描式多功能读数仪－靛酚蓝比色法测定水样铵态氮含量［J］.中国土壤与肥料，2018（4）：166-170.

［6］ 王若斐，刘超，操一凡，等.不同碳氮比猪粪堆肥及其产品肥效［J］.中国土壤与肥料，2017（6）：127-134，154.

［7］ CAPORASO J G，KUCZYNSKI J，STOMBAUGH J，et al.QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data［J］.Nat Methods，2010，7（5）：335-336.

［8］ QUAST C，PRUESSE E，YILMAZ P，et al.The SILVA ribosomal RNA gene database project：Improved data processing and web-based tools［J］.Nucleic Acids Res，2013，41：D590-D596.

［9］  EDGAR R C.Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST［J］.Bioinformatics，2010，26（19）：2460-2461.

［10］ ZGADZAJ R，GARRIDO-OTER R，JENSEN D B，et al.Root nodule symbiosis in Lotus japonicus drives the establishment of distinctive rhizosphere，root，and nodule bacterial communities［J］.Proc Nat Acad Sci USA，2016，113（49）：E7996-E8005.

［11］ 曹云，黄红英，孙金金，等.超高温预处理对猪粪堆肥过程碳氮素转化与损失的影响［J］.中国环境科学，2018，38（5）：1792-1800.

［12］ ABBASI T，GAIALAKSHMI S，ABBASI S A，et al.Towards modeling and design of vermicomposting systems：Mechanisms of composting/vermicomposting and their implications［J］.Indian J Biotechnol，2009，8：177-182.

［13］ 张蕴琦，徐凤花，张晴，等.低温环境下水稻秸秆与牛粪混合堆肥效果研究［J］.安徽农业科学，2016，44（29）：112-114，126.

［14］ 杨萍萍，尹华，彭辉，等.外接菌种对污泥堆肥效能及堆体细菌群落的影响［J］.环境科学，2017，38（8）：3536-3543.

［15］ KIRCHMANN H，WIDN P.Separately collected organic household wastes.Chemical composition and composting characteristics［J］.Swed J Agr Res，1994，24（1）：3-12.

［16］ ZUCCONI F，MONACO A，FORET M，et al.Phytotoxins during the stabilization of organic matter［M］//GASSER J K R.Compositing of agricultural and other wastes.New York：Elsevier Applied Science Publishers，1985：73-85.

［17］ 徐江兵，王艷玲，罗小三，等.纳米氧化锌对堆肥过程中细菌群落演替的影响［J］.应用与环境生物学报，2017，23（6）：1166-1171.

［18］ 田伟.牛粪高温堆肥过程中的物质变化、微生物多样性以及腐熟度评价研究［D］.南京：南京农业大学，2012：39.

［19］ 黄雅楠，王晓慧，曹琦，等.高通量测序技术分析猪粪堆肥过程中微生物群落结构变化［J］.微生物学杂志，2018，38（5）：21-26.

［20］ 任省涛，郭夏丽，芦阿虔，等.林可霉素菌渣堆肥微生物群落多样性分析［J］.环境科学，2018，39（10）：4817-4824.

［21］ ZHANG Y C，YUE D B，MA H.Darkening mechanism and kinetics of humification process in catechol-Maillard system［J］.Chemosphere，2015，130：40-45.

［22］ HARDIE A G，DYNES J J，KOZAK L M，et al.The role of glucose in abiotic humification pathways as catalyzed by birnessite［J］.Journal of molecular catalysis A：Chemical，2009，308（1/2）：114-126.