黄粉虫抗菌肽的诱导?分离及其抗菌活性研究

刘雪兰 董以雷 Dalle Zotte 伏春燕 张亨 石天虹 李霞 魏祥法 刘瑞亭 阎佩佩

摘要 ［目的］探讨不同方法诱导对黄粉虫抗菌肽活性的影响，为黄粉虫抗菌肽的修饰改造、分子克隆、外源表达等奠定基础。［方法］选 7 龄、8 龄、9 龄的黄粉虫幼虫，以巴氏杆菌和沙门氏菌为诱导菌采用微量注射法、针刺法诱导抗菌肽，对不同菌液浓度和不同方法诱导的不同龄期黄粉虫幼虫抗菌肽的抑菌效果进行研究。［结果］①黄粉虫龄期对抗菌肽活性有显著影响。釆用巴氏杆菌和沙门氏菌作为诱导菌， 对 7 龄、8 龄和9 龄黄粉虫进行诱导，在诱导处理中，8 龄幼虫诱导的抗菌肽活性显著大于其他龄期幼虫诱导的抗菌肽活性 （P<0.05）。②不同菌液浓度诱导黄粉虫幼虫产生的抗菌肽抑菌活性存在差异。菌液浓度为对数期浓度稀释100倍时抗菌肽活性显著大于其他稀释倍数诱导的抗菌肽活性 （P<0.05）。③不同方法诱导产生的抗菌肽抑菌活性存在差异。微量注射诱导的抗菌肽活性显著大于针刺诱导的抗菌肽活性 （P<0.05）。④2种细菌诱导的抗菌肽活性有显著差异。采用沙门氏菌诱导的抗菌肽最高活性显著大于采用巴氏杆菌诱导的抗菌最高活性（P<0.05）。［结论］黄粉虫抗菌肽的活性受黄粉虫龄期、诱导源微生物種类、菌液浓度、诱导方法的影响。该研究中， 以8龄黄粉虫为试验动物，采用对数期沙门氏菌液稀释100倍进行微量注射法诱导，所获得的抗菌肽活性最好。

关键词 抗菌肽；黄粉虫；抑菌活性；诱导方法

中图分类号 S899  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）06-0086-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.019

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Induction， Isolation and Antibacterial Activity of Antibacterial Peptides from Tenebrio molitor

LIU Xue-lan1，DONG Yi-lei1，Dalle Zotte2 et al

（1.Poultry Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciencces，Jinan， Shandong 250100； 2.University of Padua， Italy 35020）

Abstract  ［Objective］The purpose of this study was to explore the effects of different induction methods on the activity of Tenebrio molitor antimicrobial peptides， and lay the foundation for modification， molecular cloning， and exogenous expression of Tenebrio molitor antimicrobial peptides. ［Method］The 7， 8 and 9 instar larvae of Tenebrio molitor were selected for this study. Antibacterial peptides were induced by Pasteurella and Salmonella. Microinjection and acupuncture methods were used to study the antibacterial effects of antibacterial peptides induced by different concentrations of bacteria and different methods in Tenebrio molitor larvae of different ages. ［Result］The results showed that： ①The age of Tenebrio molitor had significant effect on the activity of antimicrobial peptides. The activity of antibacterial peptides induced by 8th instar larvae was significantly higher than that induced by other instar larvae （P<0.05）. ②The antibacterial activity of antibacterial   peptides induced by different concentrations of bacterial solution was different. When the concentration of bacterial solution was diluted 100 times of the logarithmic phase concentration， the antibacterial peptide activity was significantly higher than that induced by other dilution multiples （P<0.05）. ③The antibacterial activities of antibacterial peptides obtained by different induction methods were different. The activity of antibacterial peptides induced by microinjection was significantly higher than that induced by acupuncture （P<0.05）. ④ The activity of antibacterial peptides induced by different bacteria was significantly different. The highest activity of antimicrobial peptides induced by Salmonella was significantly higher than that   induced by Pasteurella （P<0.05）. ［Conclusion］The activity of antimicrobial peptide of Tenebrio molitor is affected by the age of Tenebrio molitor， the type of microorganism， the concentration of bacterial solution and the method of induction. In this study， Tenebrio molitor at the age of 8 was used as the experimental animal， and was induced by microinjection of salmonella solution diluted 100 times in logarithmic phase， and the antibacterial peptide activity obtained was the best.

Key words Antibacterial peptide；Tenebrio molitor；Antibacterial activity；Induction method

抗菌肽又叫抗微生物肽、肽抗生素，是生物机体在抵抗病原微生物侵染时产生的一类防御性小肽，通常为阳离子肽，含有 10～50 个氨基酸，分子量小，水溶性好，热稳定性强，无免疫原性［1］ 。它作用于革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌、寄生虫等，可以快速查杀靶标。与传统抗生素相比，抗菌肽最大的优势在于对机体安全、无毒、无副作用，病原菌不易产生耐药性，是前景广阔的新一代替抗产品。

昆虫是现今陆生动物中最繁盛的一个类群，它在漫长的进化过程中形成了独特而高效的先天防御体系。 当它受到损伤或被微生物感染后，短时间内迅速合成抗菌肽，并释放入血淋巴中作用于细菌、病毒、 真菌等［2］。黄粉虫是昆虫家族中的重要成员，其食性雜、繁殖力强、饲养简单、成本低，是很好的抗菌肽资源，引起科研工作者的广泛关注。谢咸升等［3-7］学者曾对黄粉虫抗菌肽的诱导、抗菌肽活性等进行了研究，但这些研究尚不系统，结果也不一致。为此，笔者对黄粉虫抗菌肽的诱导、分离及其活性进行了较系统的研究，以期为黄粉虫抗菌肽的修饰改造、分子克隆、外源表达等奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物。采用刘光华等［8］对虫龄的划分方法，选取 7、8、9 龄3个龄期的黄粉虫幼虫作为供试昆虫，进行相关试验。 由济南秀泉黄粉虫养殖中心提供。

1.1.2 试验菌种。巴氏杆菌、沙门氏菌，该单位保存。

1.2 方法

1.2.1 黄粉虫的饲养。黄粉虫饲养在专门的养虫室 （温度 25～30 ℃ ，湿度 50%～80%），饲喂专门配制的饲料，饲料含水率控制在15%左右， 以保证黄粉虫发育整齐。

1.2.2 抗菌肽诱导方法。

1.2.2.1 特定浓度菌液对黄粉虫幼虫抗菌肽的诱导。

（1）注射诱导。将以上试验菌分别在 LB 肉汤培养基中培养至对数生长期，离心收集菌体，用无菌去离子水将菌液配制成 0.5 个麦氏比浊度，然后将菌液与 0.2%甲醛溶液在 28 ℃混合培养 12 h 进行灭活。

取饲养至 7、8和9 龄的幼虫放入培养皿中，每个组 60 头，每组分别用微量注射器注射菌液 0.8、1.2、1.6 pL ，在最佳条件下 （温度 28℃ ，湿度 70%）饲养，分别在 24、48和 72 h 收集有活力 的幼虫，-40 ℃保存， 以无诱导的幼虫作为对照。每个处理重复 6 次。

（2）针刺诱导。取 7 、8 和 9 龄幼虫各 60 头为 1 组，共 3 组，用昆虫针蘸取上述方法处理好的菌液，针刺幼虫体壁，分别为 1 次、 2 次和 3 次，在最佳条件下饲养 （温度 28 ℃ ，湿度 70%），于 72 h 收集有活力的幼虫于-40 ℃保存， 以无诱导的幼虫作为对照。每个处理重复 6 次。

1.2.2.2 不同浓度菌液对黄粉虫幼虫抗菌肽的诱导。

（1）注射诱导。取培养至对数生长期的巴氏杆菌、沙门氏菌菌液，离心收集菌体，加入 1mL无菌去离子水配制成菌悬 独液，再用无菌去离子水将巴氏杆菌和沙门氏菌分别稀释10 倍、100 倍、1000 倍，分别选取 7 龄、8 龄和 9 龄的黄粉虫各 6 0 头作为 1 组，共取 3 组。用微量注射器吸取 l pL菌液，从黄粉虫幼虫的背部注入。注射后继续饲养 （温度28 ℃，湿度 70%），3 天后收集存活的幼虫，-40 ℃保存，以未处理的幼虫为对照。每个处理重复6次。

（2）针刺诱导。菌液制备同上。用昆虫针蘸取菌液，针刺幼虫体壁，每只幼虫扎刺 3 下，然后将诱导后的幼虫在最佳条件下 （温度 28℃ ，湿度 70%）分别继续饲养，3 d后收集存活的幼虫，-40 ℃保存， 以未处理的幼虫为对照。每个处理重复 6 次。

1.2.3 抗菌肽的提取。取-40 ℃保存黄粉虫幼虫 0.5 g，加入1.5 mL的缓冲液，置于冰上充分研磨，移入 1.5 mL的离心管中，4 ℃，12 000 r/min，30 min；取出，将上清液移入新的 1.5 mL离心管中，置于 100 ℃水 浴 10 min；之后 4 ℃，12 000 r/min，离心30 min，将不含油层的粗提液移入 1.5 mL离心管中，-40 ℃保存备用。

1.2.4 抑菌试验。在超净台内取 100 pL 0.5 麦氏比浊度的菌液 （巴氏杆菌、沙门氏菌）加入 NA 固体培养基，涂布均匀， 菌液干后在培养基上放置 6 片 0.5 mm灭菌双层滤纸片 （离边缘不小于 1.5 cm ，离中心不小于 2.5 cm）， 每片滤纸片上加入 25 pL抗菌肽粗提液并封口，待培养基表面干后将培养皿倒置于 37 ℃恒温箱内培养，24 h后取出，测量抑菌圈大小，每个滤纸片测量 6 次。

1.2.5 数据处理方法。试验数据以平均值±标准差表示，用 SAS 9.1.3 统计软件进行单因素方差分析， 当差异显著时（P<0.05），采用 Duncan 氏法做多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 微量注射特定浓度菌液对黄粉虫抗菌肽的诱导

2.1.1 微量注射特定浓度巴氏杆菌对黄粉虫抗菌肽的诱导。表1结果表明：7、8、9龄黄粉虫幼虫注射特定浓度的巴氏杆菌后，诱导的抗菌肽抑菌活性显著大于未注射组 （P<0.05）；0.8 pL 组的 7 龄和 8 龄期黄粉虫抗菌肽的活性随作用时间的延长而显著增加 （P<0.05）；1.2 pL 组的7 龄黄粉虫抗菌肽的活性以 48 h最高，显著高于 24 h的 活性（P<0.05），8 龄和 9 龄黄粉虫的抗菌肽活性以 24 h的活性最高，显著高于 48 h的活性（P<0.05）； 1.6 pL 组的 7 龄黄粉虫抗菌肽活性以 72 h 最高，显著高于 24和 48 h的活性 （P<0.05），8 龄和 9 龄黄粉虫 24和 48 h的抗菌肽活性显著高于 72 h的活性（P<0.05），24和 48 h间的抗菌肽活性差异不显著 （P>0.05）。由表1 可以看出，用巴氏杆菌微量注射法诱导抗菌肽以注射 0.8 pL作用 72 h为宜。

2.1.2 微量注射特定浓度沙门氏菌对黄粉虫抗菌肽的诱导。表2结果显示：7 龄、8 龄和9 龄黄粉虫注射特定浓度的沙门氏菌后，诱导的抗菌肽抑菌活性显著大于未注射组 （P<0.05）；0.8 pL 组 7龄、8 龄、9龄期黄粉虫的抗菌肽活性随作用时间的延长而显著增加 （P<0.05）；1.2 pL 组7龄黄粉虫的抗菌肽的活性以 72 h最高，显著高于 24 h的活性（P<0.05），8 龄和 9 龄黄粉虫的抗菌肽的活性以 24 h的活性最高，显著高于 48 h和 72 h的活性（P<0.05）；1.6 pL 组的7龄黄粉虫抗菌肽的活性以 72 h最高，显著高于 24 h的活性 （P<0.05），8 龄和 9 龄黄粉虫各时间段的抗菌肽活性差异不显著 （P>0.05）。试验结果表明，以沙门氏菌微量注射法诱导抗菌肽以注射 0.8 pL 作用 72 h为宜。

2.2 针刺不同次数对黄粉虫抗菌肽的诱导

2.2.1 针刺巴氏杆菌次数对不同龄期黄粉虫抗菌肽的诱导结果。图1 结果显示：用同一浓度的巴氏杆菌针刺 7 龄黄粉虫，针刺次数对诱导的抗菌肽抑菌活性无显著影响 （P>0.05）；针刺 8 龄黄粉虫，针刺次数对诱导的抗菌肽抑菌活性有显著影响，针刺 2 次和 3 次的 抑菌活性显著大于针刺 1 次 （P<0.05）；针刺 9 龄黄粉虫，针刺次数对诱导的抗菌肽的抑菌活性也有显著 影响，针刺 3 次的抑菌活性显著大于针刺 1 次和 2 次 （P<0.05）。

2.2.2 针刺沙门氏菌次数对不同龄期黄粉虫抗菌肽的诱导结果。图2 结果表明：用同一浓度的沙门氏菌针刺7龄黄粉虫，针刺次数对诱导的抗菌肽抑菌活性有显著 影响 （P<0.05），针刺 2 次和 3 次获得的抗菌肽抑菌活性显著大于针刺 1 次 （P<0.05）；针刺 8 龄黄粉虫，针刺次数对诱导的抗菌肽抑菌活性无显著影响 （P>0.05）；针刺 9 龄黄粉虫，针刺次数对诱导的抗菌肽的抑菌活性也有显著影响，针刺 1次和3次的抑菌活性显著大于针刺 2 次 （P<0.05）。

2.3 微量注射不同浓度菌液对黄粉虫抗菌肽的诱导

2.3.1 微量注射不同浓度巴氏杆菌液对不同龄期黄粉虫抗菌肽的诱导。图 3 结果显示：用不同浓度的巴氏杆菌注射 7 龄黄粉虫诱导的抗菌肽活性以 1/100组最高，显著高于1/10组和 1/1 000 组（P<0.05）；对于 8 龄黄粉虫抗菌肽的诱导，1/10组和 1/100 组的活性显著大于 1/1 000组 （P<0.05）；用 9 龄黄粉虫进行抗菌肽诱导，1/10 组的活性显著大于 1/100组和 1/1 000组 （P<0.05）， 1/100组显著大于 1/1 000组（P<0.05）。

2.3.2 微量注射不同浓度沙门氏菌液对不同龄期黄粉虫抗菌肽的诱导。图4显示：用不同浓度的沙门氏菌注射 7 龄黄粉虫诱导的抗菌肽活性以 1/100 组最高，显著高于 1/10 组和1/100组（P<0.05）；对于 8 龄黄粉虫抗菌肽的诱导，各注射组的活性显著大于对照组 （P<0.05），注射组間差异不显著 （P>0.05）；用 9 龄黄粉虫进行抗菌肽诱导，1/10 组的活性显著大于 1/100 组和 1/1 000组（P<0.05），1/100 组和1/1 000组间差异不显著 （P>0.05）。

2.4 针刺不同浓度菌液对黄粉虫抗菌肽的诱导

2.4.1 针刺不同浓度巴氏杆菌液对不同龄期黄粉虫抗菌肽的诱导。

图5显示：用不同浓度的巴氏杆菌液针刺 7 龄黄粉虫诱导的抗菌肽活性以 1/100 组最高，显著 高于 1/10 组和 1/1 000 组 （P<0.05）；对于 8 龄黄粉虫抗菌肽的诱导，1/10 组和 1/100 组抗菌肽的活性显著大于 1/1 000 组和对照组（P<0.05）；用 9 龄黄粉虫进行抗菌肽诱导时，1/100 组的活性显著大于 1/1 000组和对照组 （P<0.05），1/10 组和 1/100 组之间差异不显著 （P>0.05）。

2.4.2 针刺不同浓度的沙门氏菌对不同龄期黄粉虫抗菌肽的诱导。图6结果显示：用不同浓度的沙门氏菌针刺 7 龄黄粉虫诱导的抗菌肽活性以 1/100 组最高，显著高于 1/10 组、1/1 000 组和对照组 （P<0.05），1/10 组活性显著大于 1/1 000组和对照组 （P<0.05），1/1 000 组和对照组间差异不显著 （P>0.05）；对于 8 龄黄粉虫抗菌肽的诱导，1/10 组和1/100组抗菌肽的活性显著 大于 1/1 000 组和对照组 （P<0.05），1/10 组和 1/100 组之间、1/1 000 组和对照组之间差异不显著 （P>0.05）； 用 9 龄黄粉虫进行抗菌肽诱导时，1/100组的活性显著大于 1/10 组、1/1 000 组和对照组 （P<0.05），1/10组和 1/1 000 组之间差异不显著 （P>0.05）但显著大于对照组 （P<0.05）。

3 讨论

3.1 黄粉虫龄期对抗菌肽活性的影响 该研究发现，黄粉虫龄期对抗菌肽活性有显著影响。用微量注射特定浓度巴氏杆菌液的方法诱导时， 注射的 3 种剂量均以 8和9 龄的黄粉虫诱导的抗菌肽活性最大；注射特定浓度沙门氏菌 液诱导时，注射剂量为 0.8和1.2 pL 时， 以8和9龄的黄粉虫诱导的抗菌肽活性最好，注射剂量为 1.6 pL 时，各龄期之间抗菌肽的活性趋同。微量注射不同浓度的巴氏杆菌和沙门氏菌菌液进行诱导时，7 龄黄粉虫抗菌肽的活性最好。针刺相同浓度菌液进行抗菌肽的诱导时，7 龄和 8 龄黄粉虫抗菌肽的活性高于9 龄黄粉虫诱导的抗菌肽活性。针刺不同浓度巴氏杆菌和沙门氏菌菌液时，8和9 龄黄粉虫抗菌肽的活性高于 7 龄。综上，无论采取注射诱导还是针刺诱导，诱导源无论是巴氏杆菌还是沙门氏菌，以 8 龄黄粉虫最佳。陈锐［9］分别以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为诱导源，分别诱导 8、9、10龄黄粉虫抗菌肽时，各龄期的诱导效果不同，与该研究结果基本一致，但是不同的是，其认为9 龄黄粉虫诱导效果最好，可能是由于诱导源不同所致。

3.2 诱导源的微生物种类对抗菌肽活性的影响 该研究中，2种细菌诱导的抗菌肽活性有显著差异。 以沙门氏菌为诱导源所获得的抗菌肽最高活性大于以巴氏杆菌为诱导源获得的抗菌肽最高活性。谢咸升等［10］研究表明，不同菌源诱导免疫的黄粉虫抗菌肽抑菌活性存在明显差异。陈锐［9］分别以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为诱导源采用多种诱导方法对黄粉虫 抗菌肽进行诱导，2种细菌所获得的抗菌肽活性也有较大差异。 因此，微生物的种类对诱导的黄粉虫抗菌肽活性具有显著影响。

3.3 不同诱导方法对抗菌肽活性的影响 该研究分别用微量注射法和针刺法对黄粉虫抗菌肽进行诱导，针刺法所获抗菌肽的抑菌圈直径最大为 0.80 mm，微量注射法所得抗菌肽的抑菌圈直径最大为 0.91 mm 显著大于针刺法， 由此可以看出，不同诱导方法诱导的抗菌肽活性有差异。陈锐［9］分别用注射法、微量注射法、饲喂法诱导黄粉虫抗菌肽，诱导效果之 间的关系为微量注射法>注射法>饲喂法。陶淑霞等［6］采用紫外线、超声波、菌液饲喂、菌液注射对黄粉虫进 行抗菌肽的诱导，结果表明：不同诱导方法的黄粉虫幼虫血淋巴抑菌活性大小为菌液注射＞紫外线＞菌液饲喂＞超声波。董杰超［11］采用针刺大肠杆菌法、超声法、紫外线照射法诱导黄粉虫抗菌肽，发现针刺大 肠杆菌法诱导的抗菌肽活性显著大于超声法和紫外线法，超声法和紫外线法间结果差异不显著。该研究及以上学者的研究结果表明，黄粉虫抗菌肽的抑菌活性受诱导方法的影响。

3.4 菌液浓度对诱导的抗菌肽活性的影响 该研究发现，不同浓度菌液诱导的抗菌肽活性有显著差异，且活性随菌液浓度的变化有一个峰值， 以 稀释 100 倍时诱导的抗菌肽活性最大， 当稀释 1 000 倍时活性降低。陶淑霞等［6，9，11］与该研究得出的结果一致。陶淑霞等［6］用 5 龄黄粉虫诱导抗菌肽，菌液注射剂量为 104 cfu/头时获得的抗菌肽活性大于注射剂量为 105cfu/头时的活性；董杰超［11］用浓度分别为 1×105、1×107、1×109、1×1011、1×1013个/mL的大肠杆菌诱导黄粉虫抗菌肽时，1×1011和 1×1013个/mL诱导的抗菌肽活性显著大于其他浓度组。陈锐［9］研究表明：不同菌液浓度诱导黄粉虫幼虫产生的抗菌肽抑菌活性上存在差异；他将一定浓度的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别稀释 10、100、1 000 倍，经过3种不同浓度的菌液诱导后发现，所有不同菌液浓度诱导处理中，菌液浓度为对数期浓度稀释 100 倍时效果较好。

4 结论

诱导的黄粉虫抗菌肽活性受黄粉虫龄期、诱导源种类、菌液浓度、诱导方法的影响。该研究中，以 8 龄黄粉虫为试验动物，采用对数期沙门氏菌液稀释 100 倍进行微量注射所获得的抗菌肽活性最大。

参考文献

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