高效氟氯氰菊酯降解菌的分离与降解特性研究

张婧一 彭清忠 易浪波

摘要 ［目的］筛选降解高效氟氯氰菊酯（β-CF）的微生物菌种资源，并研究其降解特性。［方法］利用梯度压力驯化法，从曾使用拟除虫菊酯类杀虫剂的土壤中富集筛选降解β-CF的候选菌株，通过形态学和基于16S rRNA基因序列系统发育分析鉴定其分类地位，采用单因素试验研究菌株对β-CF的耐受性和降解特性。［结果］筛选获得1株以β-CF为唯一碳源生长、环境适应能力强的细菌GM4，经鉴定该菌为嗜油不动杆菌（Acinetobacter oleivorans）。菌株GM4对β-CF的耐受浓度可以达到600 mg/L，在初始浓度50 mg/L、pH 8.0、接菌量10%、温度28 ℃条件下培养48 h后，对β-CF降解率为99.44%。［结论］菌株GM4能高效降解β-CF，是环境中β-CF类农药残留生物修复的优良种质资源。

关键词 高效氟氯氰菊酯；降解菌；分离；耐受性；降解特性

中图分类号 X 172  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）06-0001-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.001

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Isolation and Degradation Performance of a Beta-cyfluthrin-degrading Strain

ZHANG Jing-yi，PENG Qing-zhong，YI Lang-bo

（School of Biological Resources and Environmental Sciences，Jishou University，Jishou，Hunan 416000）

Abstract ［Objective］To screen the highly efficient degradation strains of beta-cyfluthrin （β-CF），and study their degradation characteristics.［Method］Gradient pressure acclimation was used to enrich and screen candidate strains for degradating β-CF from soil that had been used pyrethroids，and the taxonomic status was identified by morphological characteristics and phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequence.The tolerance and degradation characteristics of candidate strains to β-CF were investigated by single-factor experiments.［Result］A dominant strain GM4 with strong environmental adaptability was obtained by screening，and the strain was identified as Acinetobacter oleivorans.The tolerance concentration of strain GM4 to β-CF could reach 600 mg/L，and the degradation rate of β-CF was 99.44% after the initial concentration of 50 mg/L，pH 8.0，inoculation amount of 10%，and temperature of 28 °C for 48 h.［Conclusion］The GM4 strain can efficiently degrade β-CF，which is an excellent germplasm resource for the bioremediation of pesticide residues of β-CF in the environment.

Key words Beta-cyfluthrin;Degrading strain;Isolation;Tolerance;Degradation characteristic

农药作為重要的农业生产资料，在减少农作物损失、保障粮食产量安全上贡献巨大［1］。中华人民共和国国家统计局资料显示，2019年我国使用农药总计137.19万t［2］。拟除虫菊酯是通过模仿天然除虫菊素化学结构人工合成的一类杀虫剂［3-4］，具有高效、杀虫谱广等特点，在我国西北和华北等地广泛应用，其产量占据全球农药类总产量的20%［5］。高效氟氯氰菊酯（beta-cyfluthrin，简称β-CF）是新一代 Ⅱ 型含α-氰基的高效广谱拟除虫菊酯类杀虫剂［6］，作为应用最广泛的菊酯类杀虫剂之一，主要用来防治蚜虫、蓟马等害虫，同时能兼治蜱螨［7］。但是 Ⅱ 型菊酯农药普遍具有光、热稳定等特点，在环境中半衰期较长，自然环境条件下很难降解，在固相、液相、气相中的循环易引发环境中农药的残留，2009—2011年的一份研究报告表明，美国北卡罗来纳州50名成年人的782份固体食物中氟氯氰菊酯的检出率达6%［8］；2017—2019年对北京大兴区主产水果农药残留现状监测，主要残留的菊酯类农药包括氟氯氰菊酯，且在葡萄和西瓜的使用最为广泛［9］。研究表明，水中浓度为10 ng/L的β-CF等菊酯类农药就可杀死全部无脊椎生物［10］，同时也会对非目标靶性生物如家蚕、蜜蜂等益虫造成影响［11］。β-CF等菊酯类农药含有卤素基团具有脂溶性，易被人体呼吸道和胃肠道吸收［12］，对人与哺乳动物具有神经毒性［5］、生殖毒性和免疫毒性［13-14］等。越来越多的研究证明其对生态环境和人类健康具有较高的潜在风险。2020年7月欧盟发布了β-CF的正式禁用公告［15］。

微生物降解作为一种安全、有效的农药残留消除手段，逐渐成为农药环境污染的主要修复方式。研究表明环境中蕴藏着很多能够降解拟除虫菊酯类农药的细菌、真菌等微生物，如Bhatt等［16］从广西某农药厂排污口污泥中分离获得1株鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas trueperi），在30 ℃、pH 7.0条件下培养96 h，对100 mg/L的丙烯菊酯降解效率达93%；王若瑜等［17］从发酵大曲中分离到的玫瑰红红球菌（Rhodococcus rhodochrous），其对质量浓度为5 mg/L的氯氟氰菊酯降解率可达71.44%；陈锐等［18］从土壤中分离得到1株高效分解菊酯类农药的微生物菌株SSCL-3，经鉴定该菌为米曲霉（Aspergillus oryzae），该菌在无机盐培养基摇瓶培养24 h，对500 mg/L 高效氯氰菊酯的降解率可达88.9%。目前，关于拟除虫菊酯类农药降解菌的筛选和农药残留的生物修复主要集中在联苯菊酯［19］、丙烯菊酯、氯氰菊酯等老牌菊酯类农药，对β-CF这类高活性新型菊酯类农药降解菌的研究较少，急需发掘降解这类新型菊酯类农药残留的微生物资源。基于此，该研究以β-CF为唯一碳源，从使用过拟除虫菊酯农药的果园、耕地土壤中富集分离降解β-CF的细菌，通过形态特征和16S rRNA基因序列分析进行鉴定，并研究其降解特性，旨在为β-CF等拟除虫菊酯农药残留的生物修复积累种质资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验试剂。β-CF原药（纯度95%）购自广东立威化工有限公司；β-CF标准品购自北京北方伟业计量技术研究院；甲醇（色谱级）和丙酮（分析纯）购自天津市科密欧化学试剂有限公司；TaqDNA聚合酶与各种限制性内切酶均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。试验用水为Milli-Q超纯水。

1.1.2 试验仪器。Applied Biosystems MiniAmp PCR仪（中国赛默飞世尔科技有限公司）；Eppendorf Centrifuge 5424离心机（德国艾本德股份公司）；T6紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Eyela-1100真空旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）；IS-RDV1恒温振荡培养箱（美国精骐有限公司）。

1.1.3 样品。

样品采自湖南省永顺县曾使用拟除虫菊酯类虫剂的果园和耕地（28°54′11″N，110°4′12″E），共收集土壤样本6份，于无菌袋中密封，-80 ℃冰箱保存备用。

1.1.4 培养基。LB液体培养基：蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母膏5 g、pH 7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃，灭菌20 min；固体培养基中加入15 g的琼脂。富集培养基：NaCl 2.0 g、NH4NO3 5.0 g、K2HPO4 1.0 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、酵母膏1.0 g、pH 7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃，灭菌20 min，添加β-CF丙酮母液至最终浓度依次为100、200、300、400和500 mg/L。液体选择培养基：NaCl 2.0 g、NH4NO3 5.0 g、K2HPO4 1.0 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、pH 7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃，灭菌20 min，添加β-CF丙酮母液至最终浓度为500 mg/L；固体培养基中加入1.5%的琼脂。

1.2 试验方法

1.2.1 β-CF降解菌的富集与分离。

称取土样10 g加入装有90 mL无菌水的250 mL锥形瓶中，于28 ℃、150 r/min 振荡2 h，静置30 min，取上清液，按1%接菌量（体积比）接种至含100 mg/L β-CF农药的富集培养基中，恒温振荡（28 ℃，150 r/min）培养5 d，转接至β-CF浓度提高100 mg/L的新鲜富集培养基中继续培养5 d，如此驯化，直至β-CF浓度提高至500 mg/L时振荡培养5 d，驯化结束。

按1%接菌量取驯化液接种至β-CF为唯一碳源的液体选择培养基中，继续培养5 d，转接2次，取50 μL培养液涂布在固体选择培养基上，于28 ℃恒温培养箱培养48 h，待菌落长出，选取不同形态特征的单菌落，四分体划线纯化培养，转接3次。对筛选出的优势菌株置于20%的甘油管中于-80 ℃保存备用。

1.2.2 分离菌株的形态观察与分子鉴定。

1.2.2.1 菌株的形态观察。

取单菌落在LB固体培养基和固体选择培养基上划线，于28 ℃培养24 h，观察菌落生长情况和形态特征。收集纯化后的新鲜菌体至1.5 mL EP管中，用0.9%的NaCl溶液漂洗菌体2～3次，5 000 r/min离心3 min，去上清后加入1 mL浓度为2.5%的戊二醛溶液，轻摇充分混匀，重悬菌液，置于4 ℃冰箱过夜固定，待镜检。

1.2.2.2 基于16S rRNA基因序列的系统发育分析。

使用細菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取分离菌株基因组DNA，以其为模板，采用16S rRNA基因通用引物（PA5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；PB5′-TTAAGGTGATCCAGCCGCA-3′）PCR扩增目的片段，反应循环参数如下：95 ℃预变性2.5 min，95 ℃变性15 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃继续延伸10 min。PCR产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

将获得的16S rRNA基因片段（序列长度约1 500 bp）测定结果在NCBI数据库中进行Blast比对，在数据库中下载关系密切的菌株16S rRNA基因序列，使用MEGA 7.0软件采用邻接法（neighbor-joining）进行聚类分析和系统发育树构建。

1.2.3 降解菌对β-CF的耐受性测定。

挑取单菌落接种至LB液体培养基，于28 ℃、150 r/min条件下振荡培养，取10 mL 对数生长期菌液，5 000 r/min离心5 min后弃上清，加无菌水10 mL重悬，重复3次，制备OD600为2.0的菌悬液，保存于4 ℃备用。

将菌悬液按2％接菌量（体积比）接种至β-CF浓度分别为0、300、600、900和1 200 mg/L的LB液体培养基中，于28 ℃、150 r/min 条件下振荡培养，每12 h取样测定菌液OD600值，试验设置3组平行。

1.2.4 环境因子对菌株生长和β-CF降解的影响。

取OD600为2.0的菌悬液接种至β-CF为唯一碳源的100 mL液体选择培养基中，于150 r/min振荡培养，分别考察β-CF初始浓度（50、100、200、300和400 mg/L）、温度（20、24、28、32和36 ℃）、接菌量（1%、3%、5%、10%、15%）和pH（5.0、6.0、7.0、8.0和9.0）对菌株生长和β-CF降解的影响，每个因素设3组平行，试验结束后取样测定菌液OD600值和β-CF浓度，根据β-CF浓度变化计算降解率。

β-CF降解率=（C0x-Cx）/C0x×100%

式中：C0x为第x小时时相应空白样品中β-CF浓度（mg/L）；Cx为第x小时样品中β-CF浓度（mg/L）。

1.2.5 β-CF浓度检测。

收集各发酵菌液于5 000 r/min下离心5 min，上清液转至250 mL烧瓶，菌体用10 mL无水乙醇重悬，离心收集上清液，转入烧瓶，重复3次合并溶液，于56 ℃负压旋转蒸干，加入丙酮溶解，定容至25 mL，样品经0.45 μm有机系微孔滤膜过滤，高效液相色谱测定β-CF浓度。对照处理同上。

β-CF检测条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（0.5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相为水∶甲醇=20∶80，等度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，进样量20 μL，柱温30 ℃，采用外标法定量。

1.3 统计分析

运用Origin 2021制图，采用SPSS 26.0软件对数据进行分析。符合正态分布且方差齐的数据组间比较采用单因素方差（ANOVA）分析，多重比较采用图基检验（Tukey test）。检验水准α=0.05。

2 结果与分析

2.1 β-CF降解菌的分离与鉴定

经过驯化和富集，分离获得1株能以β-CF为唯一碳源生长的菌株，编号GM4。菌株GM4在以β-CF为唯一碳源的固体选择培养基培养48 h发现，菌落细小，呈淡黄色，圆形、边缘规则，不透明（图1A）；接种于LB固体培养基培养24 h后观察，菌落直径2.5～3.0 mm，乳白色，圆形、边缘规则，不透明（图1B）；扫描电镜下菌体呈球杆状，单个排列，大小约为（0.3～0.5）μm×（0.5～0.7）μm（图1C）。

提取菌株GM4的基因组DNA，PCR扩增获得16S rRNA基因片段。经测序和比对分析，利用MEGA软件构建系统发育树如图2所示，菌株GM4和嗜油不动杆菌DR1（Acinetobater oleivorans DR1）聚为一支，其与Acinetobater oleivorans DR1的16S rRNA基因序列同源性高达99.99%。结合其形态学特征，鉴定该菌株为嗜油不动杆菌（Acinetobater oleivorans）。

2.2 菌株GM4对β-CF的耐受性测定

菌株GM4对β-CF的耐受性如图3所示。由图3可知，对照组（0 mg/L的β-CF）中菌株GM4的生长规律符合细菌的典型生长曲线；在β-CF浓度为300 mg/L的LB液体培养基中，菌株GM4快速进入对数生长期，36 h后菌液OD600值达到最大，为2.705，对数期后的稳定期長达52 h，表现对β-CF较强的适应性；在β-CF浓度为600 mg/L的LB液体培养基中，菌体生长呈现出与β-CF浓度为300 mg/L时相似的生长模式，但迟滞期较长，12 h后菌株快速增殖，48 h菌液OD600值最大，为2.756，较对照组最大OD600略高。在营养条件充足时，菌株能耐受较高浓度的β-CF胁迫，生长良好，且低浓度的β-CF（β-CF≤600 mg/L）胁迫对菌株的生长具有促进作用，但当β-CF浓度为900和1 200 mg/L时，菌株几乎不生长，高浓度β-CF抑制菌体繁殖，对菌株毒害作用明显。

52卷6期张婧一等 高效氟氯氰菊酯降解菌的分离与降解特性研究

2.3 菌株GM4降解β-CF特性研究

2.3.1 β-CF初始浓度对菌株GM4降解β-CF的影响。

从图4可以看出，在β-CF初始浓度为50～200 mg/L，初始浓度越大，菌株GM4对β-CF的降解率越低。当β-CF浓度为50 mg/L时，48 h最大降解率为79.91%；当β-CF浓度为200 mg/L时，菌株对β-CF的降解率达最低（39.83%），与底物浓度为100 mg/L时相比差异显著（P＜0.05），当β-CF浓度为300 mg/L时，菌株对β-CF的降解率有小幅上升，达到47.65%，与底物浓度为200 mg/L时相比差异显著（P＜0.05），随后降解率下降至38.81%，与底物浓度为200mg/L时相比差异不显著（P>0.05）。随着农药浓度的增加，菌株GM4生物量（OD600）呈先升高后下降的趋势，当β-CF浓度为100 mg/L 时，菌株生物量最大，随后生物量降低，高浓度β-CF对菌株生长有抑制作用，不外加碳源情况下，菌株GM4对β-CF胁迫更敏感。

2.3.2 温度对菌株GM4降解β-CF的影响。

从图5可以看出，在20、24和36 ℃下培养，菌株GM4对β-CF的降解率之间没有显著差异；当培养温度为28 ℃时，降解率最高，达95.61%，当培养温度为32 ℃时降解率次之，两者相比差异显著（P＜0.05）。菌株生物量（OD600）隨温度升高呈先升高后降低的趋势，当培养温度为28 ℃时，菌株生物量最大，菌液OD600为1.294。

2.3.3 接菌量对菌株GM4降解β-CF的影响。

从图6可以看出，当菌株GM4接菌量在1%～10%时，菌株生物量和降解β-CF的能力随接菌量的增大而提高，当菌株GM4接菌量为1%时，降解率仅为65.11%，菌液OD600为0.810；当接菌量为10%时，降解率达最高（98.37%），菌液OD600最高（1.331），与接菌量为1%时降解率相比差异显著（P＜0.05）；接种量为15%时与接菌量10%相比，菌株对β-CF降解率差异不显著（P>0.05）。营养物质充足的情况下，接菌量越大，菌体就会产生更多相关的代谢物质，从而加快β-CF的降解。但当接菌量为15%时，菌株的生长受到抑制，可能是由于接种量加大，微生物生长所需碳源不足，从而限制了菌株生长。因此，菌株GM4降解β-CF的最佳接菌量为10%。

2.3.4 pH对菌株GM4降解β-CF的影响。

从图7可以看出，在培养基pH为5.0～9.0时，菌株GM4的生物量（OD600）随pH的升高持续升高后趋于平稳，当pH为8.0和9.0时，菌株生长较好，当pH为8.0时，菌液OD600最高，为1.646。菌株对β-CF的降解率在中性和偏碱性条件下（pH为7.0、8.0、9.0）较之酸性条件（pH为5.0、6.0）更高，两者相比差异显著（P＜0.05），碱性条件更有利于菌株生长，也更有利于菌株对β-CF的利用。当pH为8.0时，菌株对β-CF降解率达到最高，为99.44%。当pH为5.0时，菌株对β-CF降解率为93.08%，与pH为6.0时相比，降解率差异不显著（P>0.05）。可能是因为β-CF在酸性条件下稳定，在碱性条件下更易水解，进而易被菌株利用所致。

3 结论与讨论

3.1 环境中存在降解β-CF的微生物菌种资源

国内外关于拟除虫菊酯类农药生物修复的报道甚多，但主要集中在结构较简单的菊酯类农药（如联苯菊酯、丙烯菊酯和氯氰菊酯等）降解菌的筛选和降解特性研究，关于含复杂官能团如α-氰基的新型二代高活性拟除虫菊酯类农药的微生物降解报道较少。β-CF作为一类疏水性和脂溶性较强的新型二代农药，易被油滴、土壤颗粒等吸附，田间应用时常无遮蔽喷洒或用于种子处理，因此在土壤表层和地下水中分布极广［20-21］，目前β-CF降解菌的报道主要涉及一些真菌［如黑曲霉（Aspergillus niger）、绿色木霉（Trichoderma viride）［22］］和少数细菌［如无色杆菌（Achromobacter.sp）［23］和假单胞菌（Pseudomonas.sp）［24］］。该研究通过富集驯化筛选获得1株以β-CF为唯一碳源生长的细菌GM4，经初步鉴定为嗜油不动杆菌（Acinetobater oleivorans），迄今为首次报道。菌株GM4对β-CF的耐受浓度可以达到600 mg/L，在初始浓度50 mg/L、pH 8.0、接菌量10%、温度28 ℃条件下培养48 h后，对β-CF降解率为99.44%；该菌株的筛选丰富了β-CF降解菌的种质资源。周婷等［25］曾从受石油污染的土壤中筛选获得嗜油不动杆菌（Acinetobater oleivorans），该菌对4 g/L原油的降解率为42.15%。李彬等［26］研究发现嗜油不动杆菌（Acinetobater oleivorans）对污水中的亚硝酸盐具有良好的去除效果。研究表明嗜油不动杆菌在农药、原油和无机化合物等污染物降解转化方面展现出较强的功能，在被污染的土壤和污水等环境的生物修复中具有很大的应用潜力。

3.2 菌株GM4具有高效降解β-CF的能力

菌株GM4在底物浓度为50～400 mg/L、温度20～36 ℃、接菌量1%～15%、pH 5.0～9.0的条件下生长良好，这与周婷等［25］对石油降解菌嗜油不动杆菌（Acinetobater oleivorans）的生长情况研究结果基本一致。在营养丰富的培养基中，该菌能耐受600 mg/L β-CF胁迫且生长良好；在β-CF为唯一碳源培养基中，底物浓度为400 mg/L条件下亦可正常生长，表明菌株GM4具有较强的环境适应性。通过优化降解条件发现，菌株GM4在含50 mg/L的β-CF培养基中培养48 h对β-CF的降解率可达99.44%。陈少华等［23］从农药厂排污口分离得到的一株高效降解菌P-01，初步鉴定为无色杆菌属（Achromobacter sp.），在最佳条件下，该菌株培养7 d对50 mg/L β-CF的降解率为85.1%；Saikia等［24］从生产β-CF的农药工厂附近的土壤样品中，分离得到一株施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）在8 d 内对50 mg/L的β-CF的降解率为94%，但该菌株对β-CF降解不够彻底，转化代谢产物依然含有苯环；卫正等［27］分离的中间苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium）在5 d内对初始浓度为100、200、300和400 mg/L的氟氯氰菊酯的降解率分别为84.5%、54.7%、40.0%和30.5%。总体来看，菌株GM4降解周期较短，降解效率较高，是一株修复环境中β-CF类农药残留污染的优良种质资源。

3.3 菌株GM4降解β-CF的机理有待深入研究

目前有关微生物降解β-CF的详细机制仍然不清楚，一般认为拟除虫菊酯类农药降解的关键首先是酯键的断裂［28］，还有研究表明菊酯类农药的彻底降解涉及苯酚羟化酶、邻苯二酚1，2-双加氧酶和原儿茶酸3，4-双加氧酶［29］，梁俊仕等［30］对不动杆菌Acinetobacter sp.4-D降解关键酶基因d34进行克隆表达，经同源比对和酶活验证，证实该基因编码酶为邻苯二酚双加氧酶；Zhao等［31］在探究蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus GM-01代谢β-氯氰菊酯的机理过程中还发现了苯甲酸代谢通路和邻苯二酚2，3-双加氧酶代谢通路的相关蛋白显著上调。因此，为了实现利用微生物资源对β-CF类农药残留污染的环境修复，有必要从分子水平揭示菌株GM4降解β-CF的分子机理，并结合功能基因信息推测β-CF的生物转化路径，才能全面阐明微生物降解β-CF的代谢机制。

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