氨基酸微量元素螯合物对草鱼生长性能、血清生化指标及微量元素沉积的影响

龙辛宇 郭 勇 石 勇 柳远香 陈开健 胡 毅 王赏初 钟 蕾*

(1. 湖南农业大学水产学院,长沙 410128;2.华中农业大学,武汉 430070;3.长沙兴嘉生物工程股份有限公司,长沙 410128)

近年来,随着我国水产养殖业的迅速发展,植物性蛋白质源在水产饲料中的使用比例越来越高。但植物性蛋白质中存在的抗营养因子磷酸根、磷酸氢根、植酸根、草酸根等,易与无机微量元素形成难溶化合物[1-3]。而目前,饲料中主要以无机微量元素形式添加,由于无机微量元素易与饲料中抗营养因子结合,从而降低了微量元素的生物学效价,给水产动物带来健康及环境污染等问题[4-5]。氨基酸微量元素螯合物为第三代微量元素添加剂[6],通过配位键将微量元素与氨基酸有机结合,形成具有环状结构的螯合物,具有稳定的化学结构,是一种较理想的添加形式[7-8]。其克服了第一代与第二代微量元素产品的缺点,具有更高的生物学效价,也是微量元素在体内被吸收过程中的中间物质,使金属离子更易被动物机体吸收,可以减少环境的排放[9-10]。氨基酸微量元素螯合物还能有效降低金属离子与其他营养物质的拮抗作用,减少微量元素对维生素和油脂的氧化破坏[11]。在水产动物中已有研究表明,氨基酸微量元素螯合物替代无机微量元素能够提高在黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[12]、欧洲鳇(Husohuso)[13]、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)[14]、南美白对虾(Litopenaeusvannamei)[15]、异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)[16]、中华倒刺鲃(Spinibarbussinensis)[17]等水产动物的生长性能,并降低饲料系数。此外,在草鱼(Ctenopharyngodonidellus)上也有研究表明,在饲料中添加适量蛋氨酸螯合铁[18]、复合微量元素[5]更有利于对微量元素的吸收和利用,并且改善血清生理功能,从而提高生长性能和健康水平。

草鱼是一种重要的养殖鱼类,因其生长速度快、品质细腻、味道鲜美、养殖效益好等特点而深受广大消费者和养殖户的青睐[19]。据2022年渔业统计年鉴显示,全国草鱼产量已经超过570万t,比2020年增长了3.3%[20]。而目前草鱼饲料中主要蛋白质源是以植物性蛋白质源为主,其中豆粕、棉籽粕、菜籽粕等植物性蛋白质源中含有较多的抗营养因子[21],从而会降低无机微量元素的效价。因此,本试验以草鱼为试验对象,研究氨基酸微量元素螯合物替代无机微量元素对草鱼生长性能、血清生化指标及微量元素在体内沉积的影响,为氨基酸微量元素螯合物在水产饲料中的应用提供一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

氨基酸络(螯)合铜、铁、锌、锰和无机硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、碘酸钙和亚硒酸钠均由长沙某工程股份有限公司提供。

1.2 试验饲料

以草鱼商品饲料配方为基础,配制一种以鱼粉、豆粕和菜籽粕为主要蛋白质源,豆油为脂肪源,面粉和玉米淀粉为糖源和粘合剂的基础饲料,其组成及营养水平见表1。试验配制6种等氮等脂饲料,分别为不添加微量元素铜、铁、锌、锰的基础饲料(CON),在基础饲料中添加草鱼微量元素需要量的100%无机微量元素铜、铁、锌、锰的试验饲料,记为IT100,在基础饲料中分别添加25%、50%、75%、100%的氨基酸微量元素络合铜、铁、锌、锰的试验饲料,分别记为OT25、OT50、OT75和OT100。各饲料微量元素含量见表2。

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础)

表2 各饲料微量元素含量

饲料原料经过超微粉碎以后,过60目筛,按照试验饲料配方准确称取所需原料,饲料中的微量成分用逐级扩大的方法进行均匀混合后,再将其放入V型搅拌机充分混合25 min,混和均匀以后利用膨化制粒机制成6.0 mm左右粒径的膨化饲料,于阴凉处风干后,保存于干燥通风处备用。

1.3 试验设计及饲养管理

本试验在湖南省常德市西洞庭实验基地进行,试验鱼暂养在规格为5.0 m×5.0 m×3.0 m的网箱中,进行2周的驯化。在进行试验之前,鱼苗禁食24 h,从中挑选了体重约为40 g左右的鱼苗,共计720尾。这些鱼苗被随机分成了6组,每组有3个重复,总共使用了18个网箱,每个网箱中养殖了40尾鱼苗。试验总共持续了8周,每天进行3次投喂(分别在07:00—8:30、12:00—13:30和16:30—18:00),投喂量为鱼体重的3%～6%。在整个试验期间,记录饲料投喂量、鱼苗死亡数量等相关数据,水温保持在(24±3) ℃,pH维持在7.31±0.2,溶解氧含量保持在5.0 mg/L以上。

1.4 样品采集与测定

1.4.1 生长性能及体型指标测定

养殖试验结束后,记录每个网箱草鱼的数量及重量,进行存活率、增重率、饲料系数等的计算。计算公式如下:

存活率(%)=100×(Nt/N0);增重率(%)=100×(Wt-W0)/W0;饲料系数=F/(Wt-W0);肥满度(g/cm3)=100×Wt/L3;肝体比(%)=100×Wh/Wt;脏体比(%)=100×Wv/Wt。

式中:Nt为终末尾数;N0为初始尾数;Wt为末均重(g);W0为初均重(g);d为养殖天数;F为平均饲料摄食量;Wh为肝脏质量(g);Wv为内脏质量(g);L为体长(cm)。

1.4.2 营养成分测定

草鱼及试验饲料水分含量的测定采用直接干燥法(GB 5009.3—2016),粗蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法(GB 5009.5—2016),粗脂肪含量的测定采取乙醚索氏提取法(GB 5009.6—2016),粗灰分含量的测定采用马福炉(GB 5009.4—2016),饲料的总能用GR-3500型氧弹式热量计(湖南长沙长兴高教仪器设备开发有限公司)测定。

1.4.3 草鱼血清生化、免疫指标测定

养殖试验结束后,停食24 h。从每个养殖网箱中随机挑选5尾草鱼,使用40 mg/L丁香油麻醉,通过尾静脉抽血,将血液采集于1 mL无菌注射器中,然后置于2 mL的离心管中。血液在4 ℃冰箱中静置过夜,经过3 500 r/min离心15 min后,分离血清。上清液取出并置于0.5 mL离心管中,放置于-80 ℃进行冷冻保存。

草鱼血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、尿素氮(UN)含量及碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)活性使用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定。血清中补体3(C3)、免疫球蛋白M(IgM)含量所用浙江伊利康生物技术有限公司的试剂盒测定。

1.4.4 肠道消化酶活性测定

试验结束后,停食24 h。从每个网箱中随机挑选6尾草鱼,解剖腹部取出肠道,去除内容物和周围脂肪,冲洗干净后保存。待采完样品后移入-80 ℃冰箱保存。测定前,称取解冻样品准确重量,样品稀释后离心,取上清液,胰蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶活性使用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定。

1.4.5 微量元素含量测定

试验结束后,禁食24 h,每个网箱中随机挑选6尾草鱼。其中3尾草鱼用于后续测定草鱼全身的微量元素含量。另外3尾草鱼取脊椎骨,用于测定脊椎骨的微量元素含量。测定前,将草鱼脊椎骨和全身在80 ℃烘箱中烘干,并磨成粉末后进行检测。原子吸收分光光度计可以测定的微量元素包括铜、铁、锰和锌。测定步骤包括检查是否含有有机物、称料、干灰化、硫酸溶解、空白溶解及铜、铁、锰、锌含量的测定(GB/T 13885—2017)和试验饲料溶液的测定。结果以质量分数表示,数值以mg/kg或g/kg为单位,计算公式如下:

质量分数=100×[(c-c0)×50×N]/(m×D)。

式中:c为试验饲料溶液中微量元素的含量,单位为μg/mL;c0为空白溶液元素的含量,单位为μg/mL;N为稀释倍数;m为试验饲料的质量,单位为g;D为常数,数值以mg/kg表示时为103,以g/kg表示时为106。

1.5 数据统计与分析

本试验原始数据使用Excel进行处理,再利用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),当单因素方差分析组间差异显著时,则用Duncan氏法进行多重比较,P<0.05为差异显著。试验数据用“平均值±标准误”表示。

2 结 果

2.1 氨基酸微量元素螯合物对草鱼生长性能的影响

由表3可知,不同组间草鱼的存活率、肥满度、肝体比和脏体比没有显著差异(P>0.05)。与CON组相比,IT100组、OT75组增重率显著升高(P<0.05),而饲料系数的变化趋势则与之相反,OT50组和OT75组与CON组比较显著降低(P<0.05)。

表3 氨基酸微量元素螯合物对草鱼生长性能的影响

2.2 氨基酸微量元素螯合物对草鱼肠道消化酶活性的影响

由表4可知,与CON组相比,IT100组、OT50组、OT75组、OT100组肠道胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性显著升高(P<0.05),OT25组的肠道淀粉酶活性显著升高(P<0.05)。

表4 氨基酸微量元素螯合物对草鱼肠道消化酶活性的影响

2.3 氨基酸微量元素螯合物对草鱼体成分的影响

由表5可知,饲料中添加2种不同形式微量元素对草鱼幼鱼鱼体粗脂肪、粗灰分、粗蛋白质和水分含量均无显著影响(P>0.05);并且不同添加比例氨基酸微量元素螯合物对草鱼体成分也无显著影响(P>0.05)。

表5 氨基酸微量元素螯合物对草鱼体成分的影响

2.4 氨基酸微量元素螯合物对草鱼脊椎骨微量元素含量的影响

由图1可知,饲料中添加2种不同形式微量元素均能提高草鱼脊椎骨内铁、铜、锰和锌的含量,但与IT100组相比,OT100组的草鱼脊椎骨中铁、铜、锰和锌的含量显著上升(P<0.05)。随着氨基酸微量元素替代比例的增加,草鱼脊椎骨中铁、铜、锰、锌含量上升,其中在OT100组表现为最高值,且OT100组脊椎骨铜和锰的含量显著高于其他组(P<0.05),OT100组脊椎骨铁的含量显著高于CON组、OT25组、OT50组和IT100组(P<0.05),OT100组脊椎骨锌的含量显著高于CON组、OT25组和OT50组(P<0.05)。此外,通过氨基酸微量元素螯合物单个元素含量曲线模型与无机微量元素含量进行比较(图2),得出铜、铁、锌、锰含量分别在67.53%、58.22%、58.68%、56.07%可达到无机微量元素100%效价。

数据柱标注不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图2 草鱼脊椎骨氨基酸微量元素含量与无机微量元素含量比较曲线模型

2.5 氨基酸微量元素螯合物对草鱼鱼体微量元素含量的影响

由图3可知,饲料中添加2种不同形式微量元素均能提高草鱼鱼体微量元素沉积,但OT100组的草鱼鱼体中铁、锰和锌的含量显著高于IT100组(P<0.05)。随着氨基酸微量元素替代比例的增加,草鱼鱼体中铁、铜、锰、锌含量上升,其中,铁、铜、锰和锌含量在OT100组表现为最大值,且OT100组鱼体中铁的含量显著高于其他组(P<0.05),OT100组鱼体中锌、锰含量与OT75组相比无显著差异(P>0.05),但显著高于其他组(P<0.05)。

图3 氨基酸微量元素螯合物对草鱼鱼体微量元素含量的影响(干重基础)

2.6 氨基酸微量元素螯合物对草鱼血清生化及免疫指标的影响

由表6可知,各组间草鱼血清中酸性磷酸酶活性、免疫球蛋白M含量无显著影响(P>0.05)。与IT100组相比,CON组的血清中总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、尿素氮含量及谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性显著升高(P<0.05),补体3、高密度脂蛋白胆固醇含量和碱性磷酸酶活性显著降低(P<0.05)。随着氨基酸微量元素螯合物替代100%无机微量元素比例的上升,草鱼血清中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、尿素氮含量以及谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性呈下降的趋势,补体3、高密度脂蛋白胆固醇含量和碱性磷酸酶活性变化趋势与其相反。其中与CON组比较,OT各组血清甘油三酯含量均显著降低(P<0.05),总胆固醇、尿素氮含量及谷丙转氨酶活性在OT100组显著降低(P<0.05),低密度脂蛋白胆固醇含量和谷草转氨酶活性在OT75组和OT100组显著降低(P<0.05),碱性磷酸酶活性在OT100组显著上升(P<0.05)。此外,通过比较在饲料中添加2种不同形式微量元素发现,OT100组草鱼血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、尿素氮含量以及谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性显著低于IT100组(P<0.05),且OT100组碱性磷酸酶活性显著高于IT100组(P<0.05)。

表6 氨基酸微量元素螯合物对草鱼血清生化及免疫指标的影响

3 讨 论

3.1 氨基酸微量元素螯合物对草鱼生长性能的影响

众多研究表明,氨基酸微量元素螯合物被视为相对于无机微量元素而言更为优越的形式来源。如军曹鱼(Rachycentroncanadum)对饲料中蛋氨酸铜的生物利用率是硫酸铜的1.53倍[22]。在黄颡鱼饲料中使用氨基酸微量元素螯合物替代无机微量元素,表现出更高的生长性能[12]。并且添加羟基蛋氨酸微量元素螯合物也能显著提高珍珠龙胆幼鱼增重率,与无机微量元素相比增重率提高了31.23%[23]。在本研究中,饲料中添加氨基酸微量元素能有效提高草鱼幼鱼的增重率,降低饲料系数,并在OT75组生长性能显著优于其他各组。这与之前在斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[24]和虹鳟[25]上研究结果类似。这些结果表明了氨基酸微量元素螯合物替代无机微量元素可以促进水产动物的生长性能。其可能原因是:1)氨基酸微量元素螯合物具有较高的生物学效价,可以阻止微量元素在肠道中转化为不溶性或不可吸收的化合物,或阻止其在不溶性胶体上的强吸附,从而提高草鱼吸收和利用[26];2)氨基酸微量元素螯合物通过小肽和氨基酸的吸收机制被肠道组织整体吸收,穿过黏膜、细胞膜进入血浆,并能被有效地吸收并循环到靶组织中,从而有利于鱼体对金属离子的充分吸收与利用[27-28];3)氨基酸微量元素螯合物含有多种氨基酸,这些氨基酸优先被肠道用作营养物质[29]。此外,本研究还发现,OT100组草鱼的生长性能有被抑制的现象,并且OT100组生长性能与IT100组相比无显著差异,其中主要的原因是高含量的氨基酸微量元素螯合物使得草鱼鱼体微量元素含量较高,而较长时间处于这种饲料环境下可能会损害鱼类生长和健康。这与之前的一些研究结果类似,即饲料中高含量的微量元素会导致建鲤(CyprinuscarpiovarJian)[30]、尼罗河罗非鱼[31]以及黄颡鱼[32]的生长受到抑制。

消化酶是反映机体消化吸收能力的重要指标之一,消化酶活性越高,其消化吸收对应营养物质的能力就越强[33]。本研究中,饲料中添加氨基酸微量元素螯合物可提高草鱼肠道淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性,并在OT75组淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性优于其他各组,但OT100组草鱼肠道消化酶活性与IT100组相比无显著差异,这一研究结果与草鱼增重率结果一致。

3.2 氨基酸微量元素螯合物对草鱼血清生化指标的影响

血清生理生化指标是反映动物健康的重要指标[34]。通常与鱼体的糖类、脂肪、蛋白质等代谢相关[35]。总胆固醇参与鱼体细胞膜的形成,甘油三酯则与鱼体的能量代谢密切相关,血清中总胆固醇和甘油三酯被统称为血脂,能够反映出鱼类脂质代谢的程度[36]。当鱼体脂质代谢紊乱会导致血总胆固醇含量上升[37]。血清中高密度脂蛋白胆固醇与低密度脂蛋白胆固醇的比值被视为胆固醇转运平衡的指标[38]。在本试验中,饲料中不同比例的氨基酸微量元素螯合物替代100%无机微量元素能有效降低草鱼血清中总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇含量,并在OT100组达到最低,且显著低于IT00组。这与在凡纳滨对虾[39-40]中的研究结果相似。这表明饲料中氨基酸微量元素螯合物能更好地保护肝胰脏的正常脂质代谢,且氨基酸微量元素螯合物效果优于无机微量元素。可能原因是氨基酸微量元素螯合物使鱼体中铜、锰含量上升,铜对动物机体脂质代谢起重要作用,能有效提高鱼类机体对脂肪的消化率[41],并且锰具有促进胰岛素的作用,能影响胰岛素和胰岛素调节下的脂蛋白脂酶活性,而脂蛋白脂酶负责清除血清中甘油三酯和控制组织对甘油三酯的摄取[42]。

众所周知,血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶是反映肝脏损伤的重要信号之一[43]。血清中尿素氮是蛋白质分解代谢的主要含氮代谢产物,与氨基酸利用和氮沉积形成蛋白质密切相关,尿素氮含量下降表明蛋白质利用效率上升,并且可作为预测鱼类鳃和肾脏功能障碍的敏感指标[44-45]。有研究表明,饲喂蛋氨酸锌的欧洲鳇鱼血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性低于饲喂高锌饲料或对照饲料的鱼[13]。本研究结果也表明,饲料中添加氨基酸微量元素螯合物能显著降低草鱼血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性和尿素氮含量,并在OT100组显著低于其他各组。这些结果表明,饲料中添加氨基酸微量元素螯合物有利于机体肝脏健康,且效果优于无机微量元素。

3.3 氨基酸微量元素螯合物对草鱼血清免疫指标的影响

血清中含有众多免疫分子,如酸性磷酸酶可作为检测细胞组分中溶酶体的标志酶,并因外源物质的存在而改变[46]。而碱性磷酸酶是内在的质膜酶,能在应激条件下减轻对污染物的能量需求,通常被用作膜运输系统受损的指标[47]。补体3是鱼类先天免疫的另一个重要组成部分,负责各种不同的免疫效应功能,如消除入侵病原体、促进炎症反应和清除其他稳态细胞等[48]。本研究中,饲料中添加氨基酸微量元素螯合物能提高血清碱性磷酸酶活性和补体3含量,并在OT100组显著高于其他各组。这与在美洲鳗鲡饲料中添加不同形式复合微量元素的研究结果[49]类似。这说明饲料中氨基酸微量元素螯合物对草鱼先天免疫有一定的保护作用,且保护效果高于无机微量元素。可能原因是氨基酸微量元素螯合物使鱼体中锌、锰和铁的含量高于无机微量元素,而锌参与碱性磷酸酶的合成,并能促进T、B细胞的发育以及白细胞的活性,锰对白细胞的活性也有促进作用,铁能使免疫器官胸腺等结构变得紧密,吞噬细胞和淋巴细胞数目增多,促进抗体产生,增强机体抗病力[50]。

3.4 氨基酸微量元素螯合物对草鱼体内微量元素沉积的影响

水产动物全鱼与脊椎骨微量元素含量是评价鱼体对饲料中微量元素吸收利用的重要指标。本研究中,与CON组相比,随着氨基酸微量元素螯合物替代无机微量元素比例的增加,草鱼全鱼与脊椎骨中微量元素的含量均显著上升,这与在黄颡鱼中的结果[12]相似,这些结果表明,水产动物对氨基酸微量元素螯合物的吸收利用高于无机微量元素。此外,本试验通过对草鱼脊椎骨氨基酸微量元素含量与无机微量元素比较曲线模型分析得出,在本试验条件下饲料中氨基酸微量元素铜、铁、锌、锰含量分别为67.53%、58.22%、58.68%、56.07%时草鱼脊椎骨微量元素沉积量达到IT100组水平。这与在蛋鸡中的研究结果相类似,饲粮中添加氨基酸微量元素螯合物能有效促进铁、铜、锌、锰在蛋鸡体内和鸡蛋中的沉积,降低相应元素的排泄,减少对环境的污染[51]。其中可能的原因是氨基酸微量元素的消化吸收过程与无机微量元素不同,在鱼类消化过程中,饲料中无机微量元素的金属离子在肠道内被释放,并与肠道中其他饲料成分重新结合,形成不溶性复合物,从而排出体外,然而氨基酸微量元素螯合物可利用在肠道中对氨基酸的吸收机制,促进对微量元素的利用[52],并且由于氨基配体的配位共价和离子键作用,螯合物中的微量元素处于化学惰性状态,因此微量元素状态更稳定,不易发生相互作用。使微量元素受到保护,不受物理化学因素的影响,也不受植酸等饲料成分的负面影响[53]。因此,氨基酸微量元素螯合物通过肠黏膜能完整被吸收,穿过黏膜、细胞膜进入血浆[54],从而通过金属离子释放并转移到鱼类的器官系统中[55]。

4 结 论

在本试验条件下,适量氨基酸微量元素螯合物替代饲料中100%无机微量元素能够显著提高草鱼增重率,降低饲料系数,并在OT50组时达到IT100组的生长效果,能够提高草鱼对微量元素吸收利用率。根据草鱼脊椎骨微量元素沉积量的二次回归方程,氨基酸微量元素螯合物内铜、铁、锌、锰含量分别在67.53%、58.22%、58.68%、56.07%时到达100%无机微量元素效价。