沙葱乙醇提取物对奶牛血浆生化、免疫、抗氧化和激素指标的影响

2024-04-02李华北段嘉钰蒋林树敖长金

动物营养学报 2024年3期

李华北段嘉钰蒋林树敖长金* 白晨*

(1.内蒙古农业大学动物科学学院,内蒙古自治区高校动物营养与饲料科学重点实验室,呼和浩特 010018;2.北京农学院动物科学技术学院,北京农学院奶牛营养学北京市重点实验室,北京 102208)

奶牛氧化应激受到自身及外界多种因素的影响。氧化应激能够引起机体功能紊乱,甚至免疫系统损伤,从而降低机体免疫功能。奶牛氧化应激及炎症反应对奶牛机体的损伤更增加了奶牛对疾病的感染风险,进一步引发奶牛乳房炎及生殖障碍,严重地降低了高产奶牛的生产性能及利用年限[1]。卢德勋[2]系统地提出氧化应激-炎症反应-免疫功能失衡之间的联系,并总结出一个问题三个互相联动方面的理论,揭示了氧化应激是在动物生产中引起炎症反应、免疫功能失衡的重要影响因素。随着我国奶牛养殖业集约化、规模化进程的不断加快,奶牛单产水平不断提高,随之而来的是高产奶牛体内代谢压力剧增,尤其在泌乳高峰期代谢最为旺盛,更易给个体带来氧化应激的问题[3]。

部分植物提取物具有提高奶牛机体抗氧化、抗炎及免疫能力的显著功效,因此被研究者广泛研究。沙葱是我国西北半荒漠地区特有的葱属植物,广泛分布于内蒙古、陕西、甘肃等省份。沙葱及其提取物被证实具有调节反刍动物免疫力[4]、抗氧化能力[5]、抗炎[6]和促进生长[7]等生物学功能,特别是其对消除羊肉的膻味具有独特效果[8]。沙葱常见粗提物类型包括沙葱乙醇类提取物[9]、多糖类提取物[10]、精油类提取物[11]。有学者利用超高效液相色谱分析发现,沙葱的乙醇提取物中富含黄酮类、有机酸类、核苷酸类等多种生物活性物质[4]。目前,沙葱提取物对肉羊的免疫、抗氧化能力的影响及机制研究已经较为深入,但对奶牛的影响尚不明确。因此,本试验旨在通过在饲粮中添加沙葱乙醇提取物,探究其对泌乳中期奶牛血浆生化、免疫、抗氧化和激素指标的影响,以期丰富沙葱提取物生物活性功能的系统研究,并为其在奶牛生产中的应用提供科学基础。

1 材料与方法

1.1 沙葱乙醇提取物的制备

鲜沙葱购买于内蒙古自治区阿拉善左旗,65 ℃烘干、粉碎后备用。沙葱乙醇提取物采用超声波提取工艺,使用75%乙醇在真空条件下蒸发浓缩,将浓缩液制备成冻干粉末,具体提取过程参考萨茹丽[12]优化的沙葱乙醇提取物制备方法。沙葱乙醇提取物的得率为28%,其主要活性成分及含量分别为:黄酮类(26.43%)、有机酸及其衍生物(18.57%)、核苷酸及其衍生物(14.43%)、氨基酸(11.14%)、羟基肉桂酰衍生物(4.43%)、氨基酸类衍化物(3.14%)、酚胺(2.35%)、维生素(1.55%)、胆碱(1.00%)、脂类(7.22%)等[4]。

1.2 试验设计与饲养管理

试验地点位于内蒙古自治区巴彦淖尔市杭锦后旗(经度:E106°34′～107°24′,纬度:N40°26′～41°13′)。选取12头2～3胎次、体况和泌乳量相近、处于泌乳中期的健康荷斯坦奶牛,体重(605.92±11.30) kg。采用单因素随机试验设计,将12头奶牛随机分为2组,每组6个重复,每个重复1头。对照组奶牛饲喂基础饲粮,试验组奶牛饲喂基础饲粮+54 g/d沙葱乙醇提取物。沙葱乙醇提取物饲喂剂量依据课题组体外瘤胃液培养试验及奶牛干物质采食量计算得出[13]。每天采用灌服的方式饲喂沙葱乙醇提取物,以确保奶牛完全采食规定剂量的沙葱乙醇提取物。试验共持续56 d,包括预试期14 d,正试期42 d。每天02:00、14:00投喂饲料,每天01:30、09:00、16:00挤奶。试验期间奶牛自由采食、饮水和活动,同时保持牛舍洁净。

1.3 饲粮组成及营养水平

基础饲粮依据NRC(2001)[14]奶牛饲养标准配制,其组成及营养水平如表1所示。饲粮中干物质、粗蛋白质、粗脂肪含量按照GB/T 18868—2002[15]进行测定,中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量采用范氏(Van Soest)方法进行测定,粗灰分、钙、磷含量分别按照GB/T 6438—2007[16]、GB/T 6436—2018[17]、GB/T 6437—2018[18]进行测定,泌乳净能(NEL)依据NRC(2001)[14]数据计算获得。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)

1.4 样品采集

在正试期第42天,以颈静脉采血的方式采集每头奶牛血液40 mL,利用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝采血管收集,在1 295×g条件下离心10 min,得到血浆,放入1.5 mL离心管,于-20 ℃保存备用。

1.5 测定指标与方法

1.5.1 血浆生化指标

测定血浆总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、肌酐(CR)、胆固醇(CHOL)、葡萄糖(GLU)、尿素(UREA)含量及谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)活性,试剂盒均购于北京乐普生物科技有限公司,测定步骤严格按照试剂盒产品说明书操作方法进行操作,使用全自动血液生化分析仪(日立3110,Hitachi公司,日本)进行检测。

1.5.2 血浆抗氧化指标

测定血浆过氧化氢酶(CAT)(钼酸铵法)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)(比色法)、超氧化物歧化酶(SOD)(羟胺法)活性和谷胱甘肽(GSH)(微板法)、丙二醛(MDA)(TBA法)含量及总抗氧化能力(T-AOC)(ABTS法),试剂盒均购于南京建成生物工程研究所,测定步骤严格按照试剂盒产品说明书操作方法进行操作,利用酶标仪(SYNERGY-H1,BioTek公司,美国)进行检测。

1.5.3 血浆免疫指标

测定血浆免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)含量,试剂盒均购于江苏晶美生物科技有限公司,测定步骤严格按照试剂盒产品说明书操作方法进行操作,利用酶标仪(SYNERGY-H1,BioTek公司,美国)进行检测。

1.5.4 血浆激素指标

测定血浆生长激素(GH)、催乳素(PRL)、雌二醇(E2)、胰岛素(INS)、皮质醇(HYD)含量,试剂盒均购于江苏晶美生物科技有限公司,测定步骤严格按照试剂盒产品说明书操作方法进行操作,利用酶标仪(SYNERGY-H1,BioTek公司,美国)进行检测。

1.6 数据统计与分析

试验数据使用WPS 2022进行初步整理统计后,使用SAS 9.2软件中t检验进行分析,结果以平均值和均值标准误(SEM)的形式表示,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 沙葱乙醇提取物对奶牛血浆生化指标的影响

据表2可知,试验组的血浆GLU、TP、ALB、GLB、CR、CHOL含量均高于对照组,UREA含量和ALT、AST、ALP活性均低于对照组,但2组之间差异均不显著(P>0.05)。

表2 沙葱乙醇提取物对奶牛血浆生化指标的影响

2.2 沙葱乙醇提取物对奶牛血浆抗氧化指标的影响

据表3可知,试验组的血浆GSH含量和GSH-Px活性显著高于对照组(P<0.05),且血浆SOD活性极显著高于对照组(P<0.01)。试验组的血浆T-AOC高于对照组,血浆CAT活性和MDA含量低于对照组,但2组之间差异均不显著(P>0.05)。

表3 沙葱乙醇提取物对奶牛血浆抗氧化指标的影响

2.3 沙葱乙醇提取物对奶牛血浆免疫指标的影响

据表4可知,试验组的血浆IL-2和IL-10含量显著高于对照组(P<0.05),血浆IL-6含量极显著低于对照组(P<0.01)。试验组的血浆IgG、IgM、IFN-γ含量高于对照组,血浆IgA、TNF-α含量低于对照组,但2组之间差异均不显著(P>0.05)。

表4 沙葱乙醇提取物对奶牛血浆免疫指标的影响

表5 沙葱乙醇提取物对奶牛血浆激素指标的影响

2.4 沙葱乙醇提取物对奶牛血浆激素指标的影响

据表4可知,试验组的血浆GH、PRL、E2含量低于对照组,血浆INS、HYD含量高于对照组,但2组之间差异均不显著(P>0.05)。

3 讨论

3.1 沙葱乙醇提取物对奶牛血浆生化指标的影响

血浆生化指标能够直接或间接反映机体内环境稳态以及机体各组织器官之间功能表达[19],其中血浆GLU含量在一定程度上能够反映机体糖代谢状况,血浆UREA含量降低反映机体对氮的利用率提高。有研究发现,奶牛在泌乳阶段易出现能量负平衡现象,主要变化之一便是GLU含量降低(GLU含量<2.5 mmol/L)[20]。本试验中,沙葱乙醇提取物能够提高泌乳中期奶牛血浆GLU含量,同时降低血浆UREA含量。其原因可能是沙葱乙醇提取物促进瘤胃微生物繁殖,增加原虫数量以及促进瘤胃微生物蛋白的合成,促进机体对蛋白质的吸收利用,提高机体对氮的利用率,同时促进碳水化合物向丙酸发酵模式的转变,为机体提供能量[21]。有研究表明,沙棘黄酮能够提高羊血清GLU含量,降低血清尿素氮(UN)含量[22],与本试验结果相同。

GLB是机体主要的免疫性蛋白质,包括IgG、IgM、IgA等多种免疫球蛋白,是组成机体体液免疫的重要物质,同时能够刺激淋巴系统消除病原体对机体的危害[23]。本试验结果表明,沙葱乙醇提取物能够提高机体血浆GLB含量,说明沙葱乙醇提取物具有调节机体免疫的作用。这与诸多关于植物提取调节机体免疫的报道结果相同[24]。ALP是机体对钙、磷吸收机能变化的敏感指标,能反映出机体骨骼的发育状态,当其活性升高表明动物钙离子代谢出现异常,机体骨骼代谢紊乱,造成骨骼疾病发生[25]。本试验中,沙葱乙醇提取物对奶牛血浆中ALP活性无显著影响,且ALP活性在正常范围内。肾脏、肝脏是机体重要的解毒器官,有着重要的解毒防御作用。CR是一种存在于血液中的外源性代谢产物,CR需通过肾脏排出体外,当肾脏功能损伤,血液中CR含量升高,因此血液CR含量通常作为评判肾脏正常生理功能的重要指标[26-27]。TP、ALB含量均能够反映肝脏正常生理功能。ALB是维持血浆渗透压的重要物质,在血液中与有机物或无机离子结合,帮助其在血液中的运输;同时,ALB可以与重金属离子结合,消除重金属离子对机体的毒害作用;通过TP、ALB指标综合判断,肝脏蛋白质合成的生理功能正常。

AST、ALT主要存在于心肌及肝脏细胞中,当肝细胞发生损伤时,血液中AST、ALT活性会显著升高[28]。本试验中,采食沙葱乙醇提取物的奶牛血浆ALT、AST活性在数值上有一定程度的降低,这可能与沙葱乙醇提取物调节体能量代谢有关。有研究表明,处于能量负平衡状态下奶牛脂动员加强,产生大量非酯化脂肪酸,使肝脏中产生大量MDA和活性氧(ROS),诱导丝裂原活化蛋白激酶-p53/核因子E2相关因子凋亡通路的过度激活,导致肝脏损伤[29]。沙葱乙醇提取物调节肝脏脂代谢,减少氧化物质对肝脏的损伤,对奶牛的肝脏具有一定的保护作用。根据本试验结果显示,沙葱乙醇提取物对奶牛机体糖代谢、骨骼代谢及肝脏、肾脏等正常生理功能无影响。

3.2 沙葱乙醇提取物对奶牛血浆抗氧化指标的影响

奶牛在生产过程中受到多种应激因素影响,易产生过量ROS,当超过机体抗氧化系统清除能力时则产生氧化应激。过量的活性氧刺激机体代谢增强,发生脂质过氧化,并引起DNA、RNA、酶类、脂质等氧化,破坏细胞完整性,对机体造成损伤[30]。有研究发现,组织氧化自由基的产生量与耗氧量呈现正相关关系[31]。泌乳中期的奶牛处于牛奶合成的较大生理压力条件下,伴随着对能量和氧气需求的增加,乳腺细胞有氧呼吸作用增强导致产生大量ROS[32]。体内ROS大量积累致使抗氧化酶产生减少,内源性抗氧化物减少,影响正常生理功能,从而可能导致奶牛的氧化应激[33]。此外,ROS过多的积累会对机体免疫系统造成损伤,降低机体免疫力及生产性能。有研究发现,ROS不断积累会激活氧化还原敏感信号转导途径,诱导促炎因子基因的表达,从而启动炎症反应。而且进一步造成免疫细胞氧化损伤,降低机体免疫力[34]。

机体内存在抗氧化酶系统与抗氧化非酶系统共同作用,增强机体抗氧化能力[35-37]。目前增强机体抗氧化能力的方式主要通过提高抗氧化酶活性以及提高机体内抗氧化非酶物质含量,来提高机体抗氧化能力。本试验中,采食沙葱乙醇提取物的奶牛血浆GSH-Px、SOD活性升高,血浆MDA含量降低,这可能与由于沙葱乙醇提取物中含有多种抗氧化物质有关。部分黄酮类物质通过激活核因子E2相关因子2(Nrf2)-抗氧化反应元件(ARE)信号通路,促进内源性抗氧化酶的表达,增强机体抗氧化能力[38]。同时沙葱乙醇提取物可能改变牛瘤胃微生物菌群结构,促进碳水化合物发酵产生乙酸、丙酸等有机酸,降低能量负平衡。有研究表明,部分有机酸类化合物能够参与三羧酸循环供能,降低机体脂动员,减少机体MDA的产生[39]。李泽青等[40]研究复合有机酸能够提高仔猪血清SOD和GSH-Px活性,同时降低血清MDA含量,提高仔猪抗氧化能力。肖凡[41]将大豆异黄酮饲喂荷斯坦奶牛犊牛后,发现血清GSH-Px、SOD活性及T-AOC均显著升高,且血清MDA含量降低。Ding等[42]将沙葱粉饲饲喂杜寒羊后,发现血清GSH-Px、SOD活性及T-AOC均显著升高,血清MDA含量显著降低。同时,徐珊珊等[7]在对沙葱精油对羊的抗氧化研究中也有相同发现。

3.3 沙葱乙醇提取物对奶牛血浆免疫指标的影响

免疫球蛋白与抗原的特异性结合致使抗原失去致病能力,在体液免疫过程中发挥重要作用。IgG是血液中含量最高的免疫球蛋白,在体液免疫中发挥主要作用。免疫球蛋白含量的升高表明机体对病原体的抵抗能力增强。木其尔等[43]在探究沙葱黄酮对肉羊免疫能力的研究中也得到沙葱提取物可以显著提高血清IgG含量,从而得出沙葱黄酮具有调节肉羊免疫功能的结论。同样,在沙棘黄酮对肉羊免疫功能的研究中也得到相似结论[44]。IL-2是一种重要的免疫应答调控因子,具有促进B细胞与T细胞的增殖活化,同时能溶解遭受病毒感染的细胞。IL-6由单核巨噬细胞、辅助性T细胞(Th细胞)、血管内皮细胞等细胞产生,属于B细胞分化因子,是一种多功能细胞因子,可调节免疫反应、造血、急性期反应和炎症,可增进淋巴细胞的增殖,激活杀伤性T淋巴细胞和参与炎症反应,因此IL-6是一种促炎症细胞因子[45]。有研究表明,IL-6由巨噬细胞受到刺激后,激活核因子-κB(NF-κB)信号通路而被大量释放[46]。本试验中,沙葱乙醇提取物通过提高奶牛血浆中抗炎因子IL-2、IL-10含量,降低促炎因子IL-6含量,对奶牛的免疫功能具有调节作用。这可能是由于沙葱乙醇提取物中含有黄酮类物质,可抑制NF-κB信号通路,降低促炎因子IL-6的mRNA表达,同时调节抗炎因子的mRNA表达,从而提高机体抗炎能力。

王特日格乐[47]研究发现,沙葱总黄酮能够抑制脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB信号通路,从而降低促炎因子TNF-α、IL-6、白细胞介素-1β(IL-1β)及炎症介质诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、环氧化酶-2(COX-2)的mRNA表达,同时能提高IL-10的mRNA表达,达到降低炎症的效果。Vizzotto等[48]研究发现,绿茶提取物中含有儿茶素、表儿茶素等多种黄酮类物质,能够提高奶牛血液中IgG及抗炎因子含量,降低促炎因子含量,提高奶牛免疫力及抗炎能力。王翠芳[49]采用灌胃方式给与小鼠沙葱提取物,检测相关炎症因子后发现,沙葱提取物能够显著抑制IL-6的分泌,并显著提高血液中IL-10含量,其结果与本试验的结果一致。

3.4 沙葱乙醇提取物对奶牛血浆激素指标的影响

前人研究发现,植物源黄酮的化学结构与动物机体雌激素的结构相似,能与机体雌激素受体结合从而发挥雌激素的生物学功能,并能够显著影响机体激素的分泌[50]。黄酮类化合物是沙葱乙醇提取物的主要成分之一[51]。机体的生长发育需要多种激素的共同作用,其中GH促进组织生长发育,PRL、E2能够促进乳房的发育及促进乳腺的泌乳[52-53]。研究发现,大豆异黄酮通过促进雌激素受体α的表达,促进乳合成和乳腺上皮细胞的增殖[54]。本试验结果表明,沙葱乙醇提取物对泌乳中期奶牛激素指标并无显著影响。官丽辉等[55]在坝上长尾鸡饲粮中添加大豆异黄酮后发现雌激素含量呈现先升高后降低趋势,并未受到显著影响,这与本试验结果类似,其原因可能是异黄酮具有雌激素生物活性,高剂量黄酮类化合物与机体内源性雌激素争夺受体,导致雌激素分泌减少[56]。有报道指出,当饲粮营养水平降低时会促进动物生长素释放肽O-酰基转移酶的表达,从而促进GH、INS等激素的分泌[57],而胰岛素的分泌受到GLU含量的调控,本试验结果中血浆GLU含量相对稳定,这可能是INS含量没有显著变化的原因。