饲粮非植酸磷水平对14日龄仔鹅肠道组织形态、食糜酶活性及菌群结构的影响

2024-04-02黄春慧正旭城杨海明王志跃

动物营养学报 2024年3期

黄春慧李宁胥蕾正旭城杨海明王志跃

(扬州大学动物科学与技术学院,扬州 225009)

磷是动物体内的必需矿物元素,参与动物机体的生长发育及生命活动,维持了动物机体正常的生理功能。Heyer等[1]研究发现,磷具有支持免疫系统和维持肠道组织结构的功能。有研究表明,饲料中含有适宜的磷可以显著提高鱼类肠道长度和重量[2-3]。黄学琴[4]认为降低肉鸭饲粮的营养和非植酸磷(NPP)水平,可降低肉鸭肠道的绒毛长度和隐窝深度。根据以上报道可知,NPP对于动物肠道生长具有重要作用。家禽饲粮中的磷大多以植酸磷的形式存在[5],但家禽体内不产生植酸酶,对植酸磷的利用率较低[6],因此应在家禽饲粮中添加NPP。微生物的各种代谢过程都需要磷的参与[7],家禽肠道内存在大量的微生物,影响家禽的健康及生产性能[8]。肠道微生物在家禽营养吸收、饲料消化能力和免疫反应等方面起到了十分重要的作用[9]。Mann等[10]研究发现,饲粮中钙、磷含量增加,可促进断奶仔猪胃内乳酸杆菌相对丰度增加14.9%。Borda-Molina等[11]研究发现,在饲粮中添加钙、磷和植酸酶后,显著影响肉鸡肠道中微生物的定植。有研究报道,不同的钙、磷添加量对肉鸡肠道内的菌群构成和丰度产生影响[12]。目前,饲粮NPP水平与仔鹅肠道微生物间的相互作用研究甚少。本团队的前期研究表明,饲粮NPP水平显著影响仔鹅生长性能,低磷组14日龄仔鹅体重、平均日增重和平均日采食量都低于对照组和高磷组[13],但其作用机制尚未明确。在此基础上,本研究拟从仔鹅肠道形态、食糜酶活性及菌群结构等方面探究饲粮NPP水平对14日龄江南白鹅仔鹅消化功能的影响及饲粮NPP水平影响仔鹅生长性能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验采用单因素试验设计。本试验选用216只1日龄体重相近、身体健康的江南白鹅公鹅作为试验动物。试验全期试验鹅自由采食、饮水,自然光照并按常规免疫程序进行免疫,保持圈舍卫生及通风良好。将试验动物分为3组,每组6个重复,每个重复12只鹅。3个组的饲粮NPP水平分别为0.08%(低磷组,LP组)、0.38%(对照组,CP组)、0.78%(高磷组,HP组)。试验期为14 d。

1.2 试验饲粮

采用玉米-豆粕型饲粮作为基础饲粮,饲粮组成参照Li等[10]。主要原料包括:玉米、豆粕、小麦麸、稻壳等。LP组、CP组和HP组饲粮营养水平:代谢能均为11.24 MJ/kg;粗蛋白质水平分别为18.29%、18.37%和18.44%;粗纤维水平均为4.27%;钙水平分别为0.76%、0.78%和0.78%;总磷水平分别为0.35%、0.67%和1.05%;NPP水平分别为0.07%、0.39%和0.77%(实测值)。

1.3 测定指标

1.3.1 肠道指数

试验第14天,每个重复选取1只体重相近的试验鹅进行屠宰。屠宰后,将肠道取出并分离,分别测量十二指肠、空肠和回肠长度。去除肠道表面脂肪以及肠道内的食糜,称量各肠段重量。

肠道相对长度(cm/g)=肠道绝对长度(cm)/体重(g);肠道相对重量(g/g)=肠道绝对重量(g)/体重(g)。

1.3.2 肠道组织结构

试验第14天,每个重复选取1只体重相近的试验鹅进行屠宰解剖。将肠道表面脂肪清理干净,分别取十二指肠近端5 cm处、空肠和回肠中段约1 cm的肠段,用生理盐水冲洗肠道内容物后将各肠段放入4%甲醛固定液中保存,具体操作过程参考刘慧军等[14]。切片制作完成后观察并测量肠道绒毛长度、隐窝深度和肌层厚度。

1.3.3 食糜酶活性

试验第14天,每个重复选取1只体重相近的试验鹅进行屠宰解剖。分别取14日龄仔鹅的十二指肠、空肠黏膜作为试验样本,测定其碱性磷酸酶和Na+-K+ATP酶的活性。测定所采用的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,测定步骤参照相应试剂盒说明书。

1.3.4 16S rRNA基因的高通量测序与分析

由于磷主要是在空肠中进行吸收转运,与空肠中的微生物有最直接的接触,故而本研究选择对空肠内容物进行16S rRNA基因的高通量测序。去除空肠表面的脂肪,取2 cm左右空肠内容物作为试验样本。将试验样本放入EP管,-80 ℃保存。用于分析空肠内容物菌群组成及结构。样本送至上海派森诺生物科技股份有限公司进行高通量测序分析。测序区域名称:16SV3V(a),目标片段长度:480 bp。分析流程:首先对高通量测序的原始下机数据根据序列质量进行初步筛查;对于问题样本重测、补测。通过质量初筛的原始序列按照index和Barcode信息,进行文库和样本划分,并去除barcode序列。按照QIIME2 dada2分析流程进行序列去噪。对不同组的样本在不同物种分类学水平的具体组成进行展示。

1.4 数据处理

采用SPSS 18.0软件对数据进行单因素方差分析,当方差分析结果显著时,采用Duncan氏法进行多重比较。数据结果用平均值和均值标准误(SEM)表示,P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 饲粮NPP水平对仔鹅肠道形态的影响

2.1.1 对仔鹅肠道指数的影响

1.2.2 实验分组将大鼠按照随机数字法分为非糖尿病组(22只)和糖尿病组(22只),其中非糖尿病组大鼠采用随机字母法分为ZT23亚组(11只)、ZT11亚组(11只)；糖尿病组大鼠分为ZT23亚组(11只)、ZT11亚组(11只)。所有大鼠在制备模型中饲养4周，随后分别在ZT23和ZT11时间点，用戊巴比妥麻醉后，迅速打开胸腔，取出心脏。取材时间点设计参照文献[6-10]。

如表1所示,LP组十二指肠、空肠和回肠的绝对长度显著低于CP组和HP组 (P<0.05);LP组肠道相对长度均显著高于CP组和HP组(P<0.05);LP组肠道的绝对重量显著低于CP组和HP组(P<0.05),CP组回肠绝对重量显著高于其他组(P<0.05);HP组空肠和回肠的相对重量显著低于LP组和CP组(P<0.05)。

表1 饲粮NPP水平对14日龄江南白鹅肠道指数的影响

2.1.2 对仔鹅肠道组织结构的影响

如表2所示,饲粮中添加NPP对14日龄江南白鹅的肠道组织结构并无显著影响(P>0.05),各肠段之间肠道的绒毛长度、隐窝深度、肌层厚度和绒隐比并无显著差异(P>0.05)。

表2 饲粮NPP水平对14日龄江南白鹅肠道组织结构的影响

2.2 饲粮NPP水平对仔鹅肠道碱性磷酸酶和Na+-K+ ATP酶活性的影响

如表3所示,LP组十二指肠碱性磷酸酶活性显著低于HP组(P<0.05)。LP组回肠Na+-K+ATP酶的活性显著低于CP组和HP组(P<0.05)。

表3 饲粮NPP水平对14日龄江南白鹅肠道碱性磷酸酶和Na+-K+ ATP酶活性的影响

2.3 饲粮NPP水平对仔鹅空肠微生物多样性的影响

2.3.1 序列数及操作分类单元(OTU)数量统计

本试验对所有样本的有效序列,以97%的一致性进行OTU聚类,然后对OTU的序列进行物种注释。如图1所示,样品共检测出20 511个OTU,其中重复的OTU有3 531个,LP组有6 370个特有OTU,CP组有9 433个特有OTU,HP组有10 448个特有OTU。如图2所示,随着OTU数目的增大,所有组的曲线都趋于平缓,说明测序深度的增加不再影响菌种的鉴定,测序量合理。

LP、CP、HP分别表示低磷组、对照组、高磷组。下图同。

横坐标为序列数量,纵坐标为观察到的物种数量。

2.3.2 Alpha多样性分析

表4 饲粮NPP水平对14日龄江南白鹅空肠微生物Alpha多样性指数的影响

2.3.3 Beta多样性分析

为了充分说明添加不同水平的NPP对14日龄江南白鹅空肠菌群的差异,本试验进行了Beta多样性分析,分析物种的系统发育关系和相对丰度。如图3所示,在加权Unifrac距离和非加权Unifrac距离的基础上进行主坐标分析(PCoA)。在非加权Unifrac主坐标分析中,第1个主成分(PCo1)解释了样本间19.8%的变化,第2个主成分(PCo2)解释了样本间8.8%的变化。而在加权Unifrac主坐标分子中,PCo1解释了样本间64.8%的变化,PCo2解释了样本间14.9%的变化。加权Unifrac距离不仅考虑了微生物菌群成员之间的系统发育,同时还考虑了微生物在各自的菌群中相对丰度的高低。从加权Unifrac中可以看出,LP组与其他2组相比物种变异较为明显。根据非加权Unifrac可知,CP组和HP组的物种比LP组更为丰富。

A:非加权Unifrac PCoA unweighted Unifrac PCoA;B:加权Unifrac PCoA weighted Unifrac PCoA。

2.3.4 属水平下的物种聚类分析

本试验在属水平下对微生物进行了物种聚类分析,如表5所示,LP组的代尔夫特菌属(Delftia)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、不动杆菌属(Acinetobacter)和黄杆菌属(Flavobacterium)相对丰度显著高于CP组和HP组(P<0.05)。同时,LP组中KD1-23、硝化螺旋菌属(Nitrospira)、囊裸藻属(Trachelomonas)和红育菌属(Rhodoferax)的相对丰度显著低于CP组和HP组(P<0.05)。

表5 饲粮NPP水平对14日龄江南白鹅空肠微生物属水平下前10菌群分布的影响

2.3.5 门水平下的物种聚类分析

本试验在门水平下对微生物进行了物种聚类分析,如表6所示,变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和TM7为优势菌群。LP组的拟杆菌门、绿菌门(Chlorobi)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)的相对丰度显著低于CP组和HP组(P<0.05)。同时,LP组中TM7、厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度显著高于CP组和HP组(P<0.05)。这说明饲粮NPP水平会改变仔鹅空肠的菌群结构。

表6 饲粮NPP水平对14日龄江南白鹅空肠微生物门水平下前10菌群分布的影响

3 讨论

3.1 饲粮NPP水平对仔鹅肠道发育的影响

肠道是家禽消化、吸收营养物质的重要场所,因此,家禽肠道的健康发育对家禽机体健康和生产性能十分重要[15]。同样,温静[3]的研究结果表明,适宜的磷水平可以提高草鱼的肠道长度和肠道重量。本试验结果表明,随着饲粮NPP水平的升高,仔鹅的肠道绝对长度随之增加;仔鹅的十二指肠和空肠绝对重量也随着饲粮NPP水平的升高而增加。

肠道内的绒毛长度、隐窝深度和绒隐比是反映肠道吸收能力的重要指标[16]。Hou等[17]报道,肠绒毛长度和隐窝深度与肠道吸收能力密切相关。因此,隐窝深度越浅、绒毛长度越长,肠道吸收能力越好。绒毛长度缩短、营养吸收面积减少,会影响动物对营养物质的吸收能力;隐窝深度加深则表示组织细胞更新速度较快,促进绒毛发育[18]。Xu等[19]的研究表明,饲粮中NPP水平对14日龄肉鸭十二指肠肌层厚度呈线性影响。本试验结果显示,饲粮NPP水平对14日龄仔鹅肠道的绒毛长度、隐窝深度和肠层厚度没有显著影响。

3.2 饲粮NPP水平对仔鹅肠道碱性磷酸酶和Na+-K+ ATP酶活性的影响

肠黏膜是动物机体抵御外界病原侵袭、维持肠道健康的重要屏障结构[20]。Goldberg等[21]认为,肠道碱性磷酸酶在维持肠黏膜完整和改善肠道功能上具有一定的作用。肠道碱性磷酸酶能够反映肠道发育情况以及小肠上皮细胞的吸收功能,能够减少肠道炎症的发生[22]。有研究发现,肠道碱性磷酸酶主要在十二指肠表达[23],在空肠和回肠的表达较低[24]。在本试验条件下,CP组和HP组十二指肠中碱性磷酸酶活性高于LP组。这说明饲粮中足量的NPP水平可促进肠道碱性磷酸酶的分泌,减少肠道炎症的发生,改善14日龄江南白鹅仔鹅的肠道功能。

Na+-K+ATP酶又被称为钠钾泵,在维持细胞结构和细胞膜功能等方面有着十分重要的作用[25]。Na+-K+ATP酶可以通过催化ATP水解供能,调节细胞渗透压,为营养物质的吸收提供动力。ATP是细胞内的一种高能磷酸化合物,含有2个高能磷酸键,因此磷是合成ATP的重要组成成分。Na+-K+ATP酶活性的高低,可以反映出肠道对营养物质吸收能力的强弱[26]。在本试验中,随着饲粮NPP水平的增加,CP组和HP组空肠中Na+-K+ATP酶的活性显著高于LP组,饲粮NPP水平对14日龄仔鹅十二指肠中Na+-K+ATP酶的活性没有显著影响。

因此,饲粮中含有足量的NPP可能通过促进碱性磷酸酶和Na+-K+ATP酶的活性,增加小肠营养物质吸收的能量供应和上皮细胞结构的完整度,可提高肠道对营养物质的吸收能力。

3.3 饲粮NPP水平对仔鹅空肠菌群结构的影响

肠道正常生理功能的维持,离不开肠道微生物。肠道微生物结构的改变,对肠道健康有正面影响也有负面影响[27]。有研究表明,磷对于细菌的生长和增殖十分重要,并参与细菌的代谢过程[28]。在本试验条件下,饲粮NPP水平对14日龄江南白鹅仔鹅空肠微生物的Alpha指数有显著影响。LP组的表征群落内物种分布的多样性和均匀度低于CP组和HP组。由此可以看出,低磷饲粮降低了Chao1指数、Observed species指数、Shannon指数和Simpson指数,影响肠道微生物物种的丰度以及多样性。

代尔夫特菌属、苍白杆菌属、不动杆菌属和黄杆菌属广泛分布于自然界,这些细菌都属于条件性致病菌[29-32]。有研究表明,代尔夫特菌属主要出现在免疫力低下、患有严重基础病的患者中[33]。苍白杆菌属拥有5个种,包括人苍白杆菌、中间苍白杆菌、假中间苍白杆菌、嗜血苍白杆菌和特瑞特西苍白杆菌[34]。人苍白杆菌可以引起苍白杆菌的感染,而人苍白杆菌具有致病性,不仅感染人类也可以感染动物[30]。Franci等[35]研究发现,由于手术的麻醉药被人苍白杆菌污染,从而导致健康犬在犬牙清垢手术后出现致命性休克。不动杆菌属易生长,可以大量繁殖,从而破坏动物机体内微生态平衡,导致免疫力下降[36]。黄杆菌属不仅存在于自然界中,还广泛存在于动物肠道或器官中[37-38]。在本试验中,LP组的致病菌代尔夫特菌属、苍白杆菌属、不动杆菌属和黄杆菌属相对丰度显著高于CP组和HP组。由此可以推测,低磷饲粮可能会降低仔鹅的免疫力、破坏微生态平衡,使仔鹅感染致病菌,从而导致仔鹅生产性能降低。KD1-23、硝化螺旋菌属、囊裸藻属和红育菌属多在水和土壤中分布。在本试验中,LP组的KD1-23、硝化螺旋菌属、囊裸藻属和红育菌属的相对丰度显著低于CP组和HP组。但这些细菌在仔鹅中的作用机制尚未明确,还需进一步的研究。

不同的微生物菌群组成对宿主体内平衡和正常代谢有重要影响[39]。变形菌门是细菌中最大的一个群体[40],也是肠道菌群中生态失调的标志物,Shin等[41]认为,变形菌门在肠道中大量出现可以反映出肠道微生物群落结构不稳定。在本试验中,变形菌门在各组中处于重要地位,而饲粮NPP水平并未影响变形菌门的相对丰度,较为稳定。多糖是拟杆菌门的主要能量来源,它们可利用多种膳食可溶性多糖,代谢产物主要是乙酸盐和丙酸盐[42],在微生物消化和营养吸收等方面有着十分重要的作用。贾慧君[43]在肉鸡上研究发现,饲粮中NPP水平在0.39%与0.45%组的拟杆菌丰度最大,且生产性能最佳。由此可以推测,拟杆菌门丰度升高可促进肉鸡的生长发育。糖杆菌门又被称为解糖微小寄生菌[44],是需要寄生在宿主细菌上生长的细菌[45],在土壤、海水、动物和人体的口腔、胃肠道等均有分布[46-49]。有研究表明,糖杆菌门对宿主细胞具有选择性,目前糖杆菌门的宿主细菌主要是放线菌属,一小部分为假丙酸杆菌属[50-51]。糖杆菌门对于宿主细菌的有利之处在于可以使宿主细菌更好的定植,增加定植部位的菌量[52];而其对宿主细菌的负面影响在于会导致宿主细胞生长和增殖过于缓慢,甚至死亡[45]。本试验中,LP组糖杆菌门相对丰度高于其他2组,而与之相关的宿主细菌放线菌门的相对丰度在各组之间并无显著差异。但LP组的放线菌门的相对丰度比其他2组低20%,因此推测,糖杆菌门对放线菌产生负面影响。厚壁菌门是肠道中最主要的菌群之一,也是最丰富的门之一[53]。厚壁菌门与拟杆菌门都是肠道内最主要的细菌,两者之间存在相互促进的共生关系,因此,2种细菌之间的比例也十分重要。本试验中,LP组的有害菌厚壁菌门相对丰度显著高于CP组和HP组。同时,LP组的厚壁菌门相对丰度升高,拟杆菌门相对丰度降低,可以看出饲粮NPP水平过低会增加有害菌比例,降低有益菌比例。这可能是导致仔鹅对生产性能降低的原因之一。