匹多莫德对支原体感染小鼠肺功能损伤的影响及其机制研究*

王坤，李嫣

（苏州大学附属儿童医院 感染性疾病科，江苏 苏州 215000）

支原体是一种无细胞壁的病原体，可侵入呼吸道、泌尿生殖道和关节等部位，引起多种感染性疾病。支原体肺炎是支原体感染（mycoplasma pneumoniae infection，MPI）最常见的疾病之一，主要发生在儿童和青少年，占社区获得性肺炎的10%～40%，以发热、咳嗽、胸闷、呼吸困难等为主要临床特征，可伴有肺间质纤维化、肺泡蛋白沉积、肺水肿等肺功能损伤[1]。目前，抗生素是支原体肺炎的主要治疗手段，但由于支原体的耐药性和抗生素的副作用，整体疗效仍有待提升[2]。因此，迫切需要寻找新的治疗方法和药物防治支原体肺炎。匹多莫德是一种人工合成的免疫调节剂，可提高免疫力，预防或辅助治疗感染性疾病[3]。近年来有研究发现，匹多莫德联合连花清瘟可显著改善老年支气管肺炎患者肺功能，为治疗支原体肺炎提供了新的思路[4]。但匹多莫德治疗支原体肺炎的作用机制尚不清楚。本研究通过动物实验观察匹多莫德对MPI小鼠肺功能损伤的疗效及可能的机制，以期为临床提供新的药物选择和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

50只SPF级雄性BALB/c小鼠，6～8周龄，体重18～22 g，购自北京维泰瑞技术服务发展有限公司。实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0013，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2021-0065。小鼠在12 h光/暗周期、（22±2）℃恒温环境下饲养，自由进食饮水。实验前1周，小鼠进行适应性饲养。

1.2 药品与试剂

肺炎支原体标准菌株（上海舜冉生物科技有限公司），匹多莫德颗粒剂（浙江仙琚制药股份有限公司，生产批号：20030325），谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司），γ干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）试剂盒（上海信裕生物科技有限公司），兔抗小鼠核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）一抗（美国R&D公司）。

1.3 仪器

GENios Pro酶标仪（瑞士Tecan公司），Pneupac Small Animal Ventilator小动物呼吸机（美国DRE Veterinary公司），Axio Scope.A1光学显微镜（德国蔡司公司），Gel SMART凝胶成像仪（北京大龙兴创实验仪器股份公司）。

1.4 方法

1.4.1 MPI模型的复制 支原体菌液置于PPLO培养基内，在37 ℃培养箱中培养12 h后达对数生长期，当培养液颜色由红变黄时进行连续传代，以变色最高稀释浓度为颜色改变单位（color change unit，CCU），CCU/mL为菌株浓度单位，用10倍梯度稀释法将菌液稀释为1×108CCU/mL备用。40只小鼠吸入乙醚麻醉后，经移液器滴入50 μL支原体菌液（1×108CCU/mL），滴入后将鼠头后仰使菌液随自主呼吸抵达下呼吸道，滴鼻持续3 d，期间观测小鼠日常活动及体重变化，末次滴鼻6 h后采集腹主动脉血。经颗粒凝集法判断，血清滴度≥1∶160表示存在支原体抗体，且出现嗜睡、蜷缩、竖毛、少动、拒食或少食，眼角出现分泌物等临床症状为模型复制成功[5]。

1.4.2 动物分组及给药 模型复制成功后，取40只MPI模型小鼠随机分为MPI组及实验A、B、C组，各10只；另外10只健康小鼠仅滴鼻同体积生理盐水设为正常组。气血检查后1 h，实验A、B、C组小鼠分别灌胃匹多莫德颗粒（终浓度100、200、400 mg/kg溶于生理盐水）[6]。正常组、MPI组小鼠灌胃等量生理盐水，1次/d，持续3 d。

1.4.3 小动物呼吸机检测肺功能 使用腹腔戊巴比妥钠深度麻醉小鼠，沿颈部切开皮肤、肌肉和筋膜，暴露甲状腺后小心分离周围组织，避免出血，用钳子隔开颈前肌露出气管，固定气管后在气管上切开约1 mm大小切口，沿气管向下插管，置于小动物呼吸机的密闭箱中，等待一段静息呼吸后，测量每分钟通气量（minute ventilation，MV）、潮气量（tidal volume，TV）、最大呼气量（maximum expiratory volume，MEV）[7]。

1.4.4 组织取材 肺功能检测完成后采集小鼠腹主动脉血，离心取血清保存于4 ℃条件下备用。采血后脊椎脱臼处死，沿胃下缘、小肠区上部横切口开腹，暴露腹腔中、上部结构，从剑突下剪破膈肌，使肺回缩，随后向两侧扩大破口，与腹壁切口靠近，将灌注针从心轴方向进针，刺入心尖3～4 mm，开始灌流后剪破右心耳，先以生理盐水40 mL快速冲洗血管，然后用含4%多聚甲醛的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液20 mL灌注固定，先快后慢。灌注固定完成后，用解剖剪沿胸骨中线剪开胸壁，暴露肺部结构。用解剖镊和剪刀分别夹住和切断气管、支气管、肺动脉及肺静脉，取出整个肺部，用刀片单向切割成约3～4 mm厚的组织块，放入4%多聚甲醛中固定24 h，脱水、包埋、浸蜡、切片（厚度4 μm）备用。剩余肺组织投入液氮中冷冻保存备用。

1.4.5 血清氧化应激指标检测 取小鼠冷藏保存的部分主动脉血清，采用紫外分光光度法检测血清GSH-Px活性，细胞色素C还原法检测SOD活性，均严格按照试剂盒说明书进行操作[8]。

1.4.6 酶联免疫吸附试验检测血清免疫指标 取冷藏保存的部分主动脉血清，按照酶联免疫吸附试验试剂盒说明书进行操作，准备酶联免疫吸附板，将特异性抗IL-4或抗IFN-γ的单克隆抗体稀释后加入板孔中，包被在固相载体上，4 ℃过夜。去除多余的抗体，用磷酸盐缓冲液洗涤板孔，加入封闭液，室温孵育1 h，阻止非特异性结合。去除封闭液，加入标准品或待测血清样本，用不同浓度的标准品绘制标准曲线，将待测血清样本稀释到合适的范围，室温孵育2 h，使IL-4或IFN-γ与固相抗体结合。去除未结合的IL-4或IFN-γ，用磷酸盐缓冲液洗涤板孔，加入生物素标记的山羊抗小鼠IgG二抗，室温孵育1 h，使二抗与固相复合物结合。去除未结合的二抗，洗涤板孔，加入辣根过氧化物酶标记的亲和素，室温孵育30 min，使亲和素与生物素结合。去除未结合的亲和素，洗涤板孔，加入适当的底物，室温显色10～30 min，使底物在酶的作用下发生有色反应。加入终止液，停止反应，并使有色反应由蓝色变为黄色。用酶标仪在450 nm波长处读取各孔的吸光度（optical density，OD）值，并根据标准品的OD值和浓度绘制标准曲线，计算待检样本IL-4、IFN-γ水平[9]。

1.4.7 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察肺组织病理变化 取肺组织切片放在玻璃载片上，用火焰加热使其贴合。置于二甲苯中脱蜡，5 min/次，重复2次。将载片转移到乙醇中脱脂，分别用100%、95%、70%乙醇各处理2次，3 min/次。冲洗载片，苏木精染色15 min。冲洗载片，0.5%盐酸乙醇溶液分化5 s。冲洗载片，Scott氏溶液蓝化1 min，伊红溶液染色10 min。冲洗载片，用95%乙醇去除多余的伊红染料，3 min/次，重复2次。将载片转移到100%乙醇中脱水，3 min/次，重复2次。将载片转移到二甲苯中透明化，5 min/次，重复2次。用玻璃盖片覆盖载片，封片胶固定，在显微镜下观察[10]。

1.4.8 Western blotting检测肺组织Nrf2、HO-1蛋白表达 取冷冻保存的肺组织，充分研磨、匀浆、裂解，10 000 r/min低温离心10 min，离心半径15 cm，取上清液定量蛋白。取少量样本蛋白，混合4倍量上样缓冲液，水浴加热变性蛋白，以20～30 μg/孔加载到凝胶槽中，加入预染色蛋白作为分子量标准，用恒压电源进行电泳分离。将分离好的蛋白从凝胶转移到聚氟乙烯膜上，用转印仪或半干法转印。将转印好的膜用5%牛奶在室温或4 ℃封闭1～2 h，防止非特异性结合。将封闭好的膜用含适当稀释比例的Nrf2或HO-1一抗溶液在4 ℃过夜或室温2 h孵育，使一抗与目标蛋白结合。将孵育好的膜用含Tween-20的TBST缓冲液洗涤3次，10 min/次，去除未结合的一抗。将洗涤好的膜用含适当稀释比例的荧光标记的二抗溶液室温孵育1 h，使二抗与一抗结合。重复上述洗涤步骤，去除未结合的二抗。用荧光成像仪扫描和分析洗涤好的膜，根据荧光信号的强度和分子量计算Nrf2、HO-1蛋白相对表达量[11]。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肺功能指标比较

正常组、MPI组、实验A组、实验B组、实验C组MV、TV、MEV比较，经方差分析，差异均有统计学意义（F=17.626、15.133和20.238，均P=0.000）。与正常组比较，MPI组MV、TV、MEV减少（P＜0.05）；与MPI组比较，实验A、B、C组MV、TV、MEV增加（P＜0.05）；与实验A组比较，实验B、C组MV、TV、MEV增加（P＜0.05）；与实验B组比较，实验C组MV、TV、MEV增加（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠肺功能指标比较 （n=10，±s）

表1 各组小鼠肺功能指标比较 （n=10，±s）

注：①与正常组比较，P＜0.05；②与MPI组比较，P＜0.05；③与实验A组比较，P＜0.05；④与实验B组比较，P＜0.05。

MEV/（L/min）0.56±0.07 0.32±0.04①0.41±0.06②0.48±0.09②③0.53±0.07②③④20.238 0.000组别正常组MPI组实验A组实验B组实验C组F 值P 值MV/（mL/min）29.41±5.19 15.59±4.31①19.18±3.87②23.77±3.60②③28.16±4.91②③④17.626 0.000 TV/mL 0.22±0.04 0.11±0.03①0.15±0.04②0.19±0.03②③0.22±0.05②③④15.133 0.000

2.2 各组小鼠血清氧化应激指标比较

正常组、MPI组、实验A组、实验B组、实验C组血清GSH-Px、SOD活性比较，经方差分析，差异均有统计学意义（F=18.642和70.428，均P=0.000）。与正常组比较，MPI组血清GSH-Px、SOD活性降低（P＜0.05）；与MPI组比较，实验A、B、C组GSH-Px、SOD活性增强（P＜0.05）；与实验A组比较，实验B、C组GSH-Px、SOD活性增强（P＜0.05）；与实验B组比较，实验C组GSH-Px、SOD活性增强（P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠血清氧化应激指标比较 （n=10，±s）

表2 各组小鼠血清氧化应激指标比较 （n=10，±s）

注：①与正常组比较，P＜0.05；②与MPI组比较，P＜0.05；③与实验A组比较，P＜0.05；④与实验B组比较，P＜0.05。

SOD/（u/mL）68.54±7.21 21.62±5.67①36.51±7.57②48.91±5.02②③57.17±8.27②③④70.428 0.000组别正常组MPI组实验A组实验B组实验C组F 值P 值GSH-Px/（u/L）126.17±10.24 82.16±9.63①91.35±10.27②102.99±15.14②③120.03±19.91②③④18.642 0.000

2.3 各组小鼠血清免疫指标比较

正常组、MPI组、实验A组、实验B组、实验C组血清IFN-γ、IL-4水平比较，经方差分析，差异均有统计学意义（F=26.663和31.635，均P=0.000）。与正常组比较，MPI组血清IFN-γ水平降低，IL-4水平升高（P＜0.05）；与MPI组比较，实验A、B、C组IFN-γ水平升高，IL-4水平降低（P＜0.05）；与实验A组比较，实验B、C组IFN-γ水平升高，IL-4水平降低（P＜0.05）；与实验B组比较，实验C组IFN-γ水平升高，IL-4水平降低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠血清免疫指标比较 （n=10，±s）

表3 各组小鼠血清免疫指标比较 （n=10，±s）

注：①与正常组比较，P＜0.05；②与MPI组比较，P＜0.05；③与实验A组比较，P＜0.05；④与实验B组比较，P＜0.05。

IL-4/（ng/L）33.98±6.37 75.46±12.71①67.27±8.90②56.45±9.16②③48.16±7.10②③④31.635 0.000组别正常组MPI组实验A组实验B组实验C组F 值P 值IFN-γ/（ng/mL）71.69±9.40 39.43±4.55①47.52±7.13②58.38±7.42②③63.12±9.45②③④26.663 0.000

2.4 各组小鼠肺组织病理变化

HE染色结果显示，正常组小鼠肺组织结构完整，肺泡状态正常。MPI组小鼠肺组织结构受损严重，肺泡壁断裂变形，组织间隙肿胀，毛细血管扩张充血，可见大量炎症细胞浸润。实验A、B、C组小鼠肺泡壁恢复连接，组织结构成形，炎症细胞浸润减少，间隙肿胀程度变小；实验C组较实验A、B组改善更显著，呈剂量依赖性。见图1。

图1 各组小鼠肺组织病理变化 （HE染色×200）

2.5 各组小鼠肺组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量比较

正常组、MPI组、实验A组、实验B组、实验C组肺组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（F=186.820和123.063，均P=0.000）。与正常组比较，MPI组肺组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量降低（P＜0.05）；与MPI组比较，实验A、B、C组肺组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与实验A组比较，实验B、C组肺组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与实验B组比较，实验C组肺组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量升高（P＜0.05）。见表4和图2。

图2 各组小鼠肺组织Nrf2、HO-1蛋白表达

表4 各组小鼠肺组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量比较（n=10，±s）

表4 各组小鼠肺组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量比较（n=10，±s）

注：①与正常组比较，P＜0.05；②与MPI组比较，P＜0.05；③与实验A组比较，P＜0.05；④与实验B组比较，P＜0.05。

HO-1 0.46±0.04 0.04±0.01①0.21±0.03②0.28±0.07②③0.40±0.06②③④123.063 0.000组别正常组MPI组实验A组实验B组实验C组F 值P 值Nrf2 0.92±0.15 0.08±0.02①0.24±0.03②0.47±0.05②③0.76±0.08②③④186.820 0.000

3 讨论

支原体肺炎是一种由肺炎支原体引起的急性呼吸道感染伴肺炎，其主要危险因素包括与患者密切接触、秋冬季节、儿童和青年年龄段、人群密集环境、免疫力低下及合并其他呼吸道感染等[12-13]。支原体肺炎发病机制涉及支原体对宿主细胞直接损伤、宿主对支原体的免疫反应，以及支原体与其他微生物的共同作用[14-16]。作为一种无细胞壁的病原体，肺炎支原体可抵抗细胞壁靶向性抗生素，并可改变自身大小和形状以适应周围环境，从而增加耐药性和免疫逃避能力，治疗难度高[17]。尽管已经有许多药物和治疗方法用于支原体肺炎，但是疗效仍不理想，因此迫切需要寻找新的治疗策略。

Th1/Th2平衡是指机体在应对不同类型的病原体时，产生适当比例的Th1、Th2细胞，以发挥最佳的免疫效应，IFN-γ、IL-4分别是两者的代表性因子，广泛参与支原体肺炎发生、发展[18-19]。本研究结果显示，与MPI组比较，实验A、B、C组MV、TV、MEV均增加，IL-4水平降低，GSH-Px、SOD活性、IFN-γ水平均升高，提示匹多莫德可改善MPI小鼠肺功能、氧化应激及免疫功能。匹多莫德是一种由2个L-丙氨酸和1个D-苯丙氨酸组成的二肽类化合物，常用于治疗有细胞介导免疫抑制证据的肺部及泌尿道感染，其可刺激和调节细胞因子的产生和释放，从而增强非特异性自然免疫、体液免疫和细胞免疫等相关免疫反应，增强巨噬细胞、中性粒细胞的抗感染能力，促使辅助性/抑制性T细胞比值恢复正常[20-21]。XU等[22]研究认为，辅助匹多莫德治疗支原体肺炎可改善患者的炎症反应和肺功能，增强免疫功能。

Nrf2/HO-1信号通路是机体内一条重要的细胞保护通路，参与调节氧化应激、炎症和凋亡等多个生物学过程。Nrf2是该信号通路的核心转录因子，具有还原敏感性，可维持细胞内氧化还原稳态，在受到氧化应激或亲电性物质的刺激时，从细胞质中解离出来，转移至HO-1[23-24]。HO-1是一种血红素加氧酶，可将血红素降解为一氧化碳CO、胆红素和游离铁，从而发挥抗氧化、抗炎、抗凋亡和稳定血管的作用[25]。在MPI中，Nrf2/HO-1信号通路也起着重要作用。Nrf2和HO-1蛋白在肺组织中主要由Ⅱ型肺泡细胞分泌，Ⅱ型肺泡细胞是一种位于肺泡拐角处的立方形或球形细胞，具有合成、分泌肺表面活性物质的功能。Nrf2和HO-1蛋白可以保护肺泡细胞免受氧化应激和炎症反应损伤，对预防和治疗急性肺损伤等疾病有重要意义。支原体肺炎感染可导致肺组织产生大量的活性氧自由基，造成氧化应激损伤，Nrf2/HO-1通路可调节细胞内抗氧化酶和抗氧化物质的表达，清除活性氧自由基，维持氧化还原平衡，减轻氧化应激反应。支原体肺炎感染可激活细胞膜上的Toll样受体4，启动核转录因子κB信号通路，释放炎症因子，引发炎症反应，而Nrf2/HO-1通路可以抑制该信号通路的激活，减少炎症因子的表达，从而抑制炎症反应。支原体肺炎感染可通过黏附、入侵、毒素等方式直接损伤肺泡上皮细胞，导致肺泡水肿和气体交换障碍。Nrf2/HO-1通路可通过增加CO的生成，改善微循环，增加血流灌注，保护肺泡上皮细胞。有学者发现，Nrf2/HO-1信号通路活性在支原体肺炎中被抑制，激活该通路可有效减轻小鼠肺部炎症反应，促进细胞增殖并抑制其凋亡[26]。本研究结果显示，MPI小鼠经不同剂量匹多莫德干预后，肺组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量均升高，提示匹多莫德可能通过调节Nrf2/HO-1信号通路发挥对MPI小鼠的治疗作用。

综上所述，匹多莫德可能通过调节Nrf2/HO-1信号通路改善MPI小鼠肺功能及免疫功能，减轻氧化应激损伤。本研究仍存在一定不足及局限性，如研究中使用的小鼠数量较少，导致结果的可信度和推广性受到限制，且由于小鼠和人类在生理和基因上存在一定差异，实验结果可能不完全适用于人类，无法完全模拟临床情况。未来研究应增加样本量，以提高实验的统计学能力和结果的可靠性，并逐步进行临床随机对照试验，进一步观察匹多莫德对MPI的影响。