2013—2021 年云南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行与混合感染状况调查*

邓珺文，毕峻龙，李永能，程美玲，沈学文，杨贵树，尹革芬**

(1.云南农业大学 动物医学院，云南 昆明 650201；2.红河州动物疫病预防控制中心，云南 蒙自 661100)

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种高度传染性疾病。该病于1987 年首次在美国发现，并逐渐蔓延至欧洲和亚洲[1-2]，中国大陆于1995 年发现该病[3]，1996 年分离到PRRSV[4]。PRRSV 具有高度遗传多样性和快速进化的特征，各基因型之间的抗原表位发生突变，导致疫苗免疫效果降低。为预防PRRSV 的传播，控制PRRS的发生，养殖场生产一线通常采用药物预防或疫苗免疫的方法，但效果有限，如何有效地控制PRRS 流行是当前面临的严峻挑战。2006 年变异毒株引起高致病性猪蓝耳病[5]给部分养猪企业造成了严重损失，近年来出现的类NADC30 毒株[6-7]和类NADC34 毒株[8]正逐步成为新的流行毒株，然而有关云南省内新发毒株的流行情况鲜有报道。本研究通过分子生物学方法检测2013—2021年间云南省部分地区收集到的血液样品，旨在调查云南省PRRS 的流行规律和混合感染情况以及PRRSV 不同基因型的流行情况，以期为PRRS 的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

于2013—2021 年采集云南省各地区不同养殖场、不同生长阶段猪群的血液样品3 112 份(表1)。其中，在3 种不同类型养殖场进行样品采集：种猪场567 份，育肥场1 650 份，散养户895份；对5 个不同生长阶段的猪群进行样品采集：哺乳仔猪556 份，保育猪943 份，生长育肥猪1 089份，种公猪71 份，种母猪453 份。

1.1.2 试验材料

病毒RNA 提取试剂RNAiso Plus、6×Loading Buffer、DL500 DNA Marker、pMD19-T 载体和大肠杆菌DH5α 感受态细胞购自宝生物工程有限公司；病毒DNA 提取试剂盒购自济凡生物科技有限公司；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis Super Mix 和2×TransTaqHigh Fidelity (HIFI) PCR SuperMix Ⅱ购自北京全式金生物技术有限公司；异丙醇、氯仿和无水乙醇均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 PRRSV 阳性样品筛选

取血液样品200 μL 放入离心管，加入RNAiso Plus 细胞裂解液1 mL，4 ℃静置10 min，12 000 r/min离心10 min；取上清后加入一半体积的氯仿，4 ℃静置10 min，12 000 r/min 离心10 min；取上清后加入等体积异丙醇，4 ℃静置10 min，12 000 r/min离心10 min；弃去管中液体后加入75%乙醇1 mL，12 000 r/min 离心5 min，弃去液体后室温放置5～10 min，最后将沉淀溶于无RNA 酶水20 μL 中，获得血液样品的基因组RNA。参考毕峻龙[9]的PRRSV RT-PCR 检测方法对总RNA 进行PCR 扩增，扩增得到的RT-PCR 产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，用DL500 DNA Marker 确定目的条带大小，在凝胶成像系统中观察结果并拍照。

1.2.2 PRRSV 感染情况调查

为进一步分析PRRSV 和其他病毒混合感染的情况，使用病毒DNA 提取试剂盒，按照相关说明书提取得到血液样品的基因组DNA。使用PCR/RT-PCR 方法进一步对PRRSV 核酸阳性样品进行猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)和猪圆环病毒2 型病毒(porcine circovirus type 2 virus，PCV2)检测，检测引物和方法参考毕峻龙[9]的研究。对阳性样品的检出率进行不同年份、不同类型养殖场、不同年龄阶段和混合感染情况分析。

1.2.3 PRRSV 基因型分析

选取保存较为完好(均为2017—2021 年的样品)且具有较强毒力的PRRSV 阳性样品共53 份，将产物纯化回收后与pMD19-T 载体连接，转化入DH5α 中，均匀涂板后放入37 ℃恒温培养箱培养16～22 h，挑取单个菌落进行富集，于恒温培养摇床(220 r/min，37 ℃)振荡过夜培养后提取质粒，并送至生工生物工程上海(股份)有限公司进行测序，得到PRRSV 的nsp2基因序列，再进行基因型分析。

2 结果与分析

2.1 PRRSV 检测结果

样品经RT-PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，得到约为330 bp 的特异性条带(图1)，表明部分样品PRRSV 核酸检测呈阳性。经统计，在2013—2021 年收集的3 112 份样品中，PPRSV 核酸阳性样品有801 份，阳性率为25.74%。

图1 PRRSV 核酸检测电泳图Fig.1 Electrophoretic detection picture of PRRSV

2.2 不同年份PRRSV 核酸检测结果

由表2 可知：2013—2018 年，PRRSV 检出率呈上升趋势；2019—2021 年，PRRSV 检出率有一定下降，但仍在20%以上。

表2 2013—2021 年送检样品PRRSV 核酸阳性率Tab.2 Positive rate of PRRSV in samples sent for testing from 2013 to 2021

2.3 PRRSV 与其他病原的双重、多重感染情况

对801 份PRRSV 核酸阳性样品进行其他疫病检测，出现双重混合感染的样品有330 份，混合感染率为41.20%。其中，检出CSFV 阳性样品78 份，阳性率9.74%；PCV2 阳性样品198 份，阳性率24.72%；PRV 阳性样品54 份，阳性率6.74%(表3)。

有100 份PRRSV 核酸阳性样品出现三重混合感染，混合感染率为12.48%；15 份样品出现PRRSV、CSFV、PRV 和PCV2 四重混合感染，混合感染率为1.87%。其中，18 份样品检出PRRSV、CSFV 和PRV 三重混合感染；50 份样品检出PRRSV、CSFV 和PCV2 三重混合感染；32 份样品检出PRRSV、PCV2 和PRV 三重混合感染(表4)。

表4 多重混合感染情况Tab.4 Situation of multiple mixed infection

2.4 不同类型养殖场PRRSV 感染情况

801 份PRRSV 阳性样品中，种猪场阳性样品81 份，检出率为14.29% (81/567)；育肥场阳性样品461 份，检出率为27.94% (461/1 650)；散养户阳性样品259 份，检出率为28.94% (259/895)。可见，相对于育肥场和散养户，种猪场PRRSV 感染程度较轻。

2.5 不同生长发育阶段猪群PRRSV 感染情况

801 份PRRSV 阳性样品中，哺乳仔猪阳性样品93 份，检出率为16.73% (93/556)；保育猪阳性样品271 份，检出率为28.74% (271/943)；生长育肥猪阳性样品362 份，检出率为33.24% (362/1 089)；种公猪阳性样品6 份，检出率为8.45% (6/71)；种母猪阳性样品69 份，检出率为15.23% (69/453)。可见，不同生长阶段猪群的PRRSV 感染程度差异较大，生长育肥猪感染最严重，其余依次是保育猪、哺乳仔猪、种母猪和种公猪。

2.6 不同毒株类型分析

由表5 可知：2017—2021 年间，高致病性毒株占58.49% (31/53)，检出数量呈逐年下降趋势；经典毒株占22.64% (12/53)，检出数量呈逐年下降趋势；类NADC30 毒株自2019 年检出后呈逐年上升趋势，占比为15.09% (8/53)；类NADC34 毒株于2021 年在云南省内首次发现，占比为3.77%(2/53)。

表5 阳性样品中的不同毒株数量Tab.5 Number of different strains in positive samples

3 讨论

1995 年在中国大陆发现了PRRS[3]；1996 年郭宝清等[4]在国内暴发PRRS 的猪群中首次分离到PRRSV；1997—1998 年对PRRSV 的血清流行病学调查发现：PRRS 在华东地区广泛存在[10]；2006 年，1 种新型PRRSV 变异毒株在中国引起非典型PRRS 的暴发，其特点是所有年龄段的猪都出现高热症状，且发病率和死亡率高，这种新型的PRRSV 被定名为高致病性猪蓝耳病[5]；2006年下半年，云南省部分地区也发生了高致病性猪蓝耳病疫情，随后分离到了PRRSV 云南毒株[11]；之后，在云南省内不断检测出PRRSV，经深入研究，证实了云南省内广泛存在PRRS，并呈现出一定的流行趋势[12-13]。本研究检测了2013—2021年间收集的3 112 份血液样品，发现有801 份样品为PPRSV 阳性，总阳性率为25.74%。在2013—2018 年间，PRRSV 检出率呈上升趋势，阳性率在21.08%～41.72%之间；近3 年来，PRRSV 检出率在22.56%～24.32%之间，虽有一定下降但仍高于20%，提示PRRSV 仍在云南省的部分养殖场中广泛流行。

近年来，临床上出现多种病原混合感染和持续性感染的现象，且呈上升趋势[14]。在云南省的部分养殖场中，繁殖障碍病毒性疾病常以PRRSV 和PCV2 的混合感染为主[15]，这2 种病毒均能够破坏宿主的免疫过程，并进一步加重混合感染的程度[16-17]。本研究进一步对801 份PRRSV 核酸阳性样品进行其他疫病检测，发现其在不同程度上与CSFV、PRV、PCV2 等病原发生混合感染。经检测，共有330 份PRRSV 核酸阳性样品出现双重混合感染，混合感染率为41.20%，且PRRSV 和PCV2 双重混合感染最为常见；共有100 份PRRSV 核酸阳性样品出现三重混合感染，混合感染率为12.48%；共有15 份样品检出PRRSV、CSFV、PRV 和PCV2 四重混合感染，混合感染率为1.87%。结果提示当前规模养殖场发生疫病的主要临床表现为PRRSV 和其他疫病混合感染，且相对于育肥场和散养户，种猪场的PRRSV 感染程度较轻；不同生长阶段猪群中，以生长育肥猪感染最严重。

PRRSV 具有基因遗传多样的特性，且不断出现新的变异毒株，尤其是近年来新发现的类NADC30 新毒株，目前已在中国多地流行[6-7]；2017年，中国新出现了类NADC34 毒株，并逐步在全国范围内流行[8]；现阶段，中国主要流行的毒株仍为类JXA1 和类NADC30 毒株[18]。本研究选取53 份PRRSV 阳性样品进行测序，并进行基因型分析，结果发现：2017—2021 年间，高致病性毒株和经典毒株占比呈逐年下降趋势，类NADC-30 毒株自2019 年检出后占比呈逐年上升趋势，类NADC34 毒株于2021 年在云南省首次发现。提示类NADC30 毒株和类NADC34 毒株等新型变异毒株已在云南省内流行，并可能会逐渐取代高致病性毒株和经典毒株成为云南省的优势毒株。

4 结论

2013—2021 年间，PRRSV 仍是对云南省生猪养殖危害最大的疫病之一，当前规模养殖场发生疫病的主要临床表现为PRRSV 和其他疫病混合感染，相对于育肥场和散养户，种猪场感染程度较轻，生长育肥猪感染最严重。类NADC30 毒株和类NADC34 毒株等新发毒株可能会成为云南省优势毒株。本研究为PRRS 的防控提供了理论参考依据。

致谢：云南省兽医生物制品研制中心兽医师朱玲云、楚雄彝族自治州动物疫病预防控制中心兽医师赵谦、石林彝族自治县畜牧兽医总站高级兽医师陈关雄、丽江市古城区农业农村局高级兽医师杨渊、云南省普文公路动物防疫监督检查站农业推广研究员郑旺华在样本采集、数据分析、流行病学调查等方面提供了大量帮助，特质诚挚谢意！