青海骆驼线粒体DNA D-loop区遗传多样性研究

高雪 晁生玉 王启菊 孟克达拉 乌兰巴特尔 贾功雪

摘 要 旨在研究青海骆驼遗传多样性，揭示青海骆驼的母系起源进化。采集柴达木地区3个青海骆驼类群耳组织样品88份并提取基因组DNA，利用PCR扩增和基因测序分析线粒体DNA D-loop序列，并与蒙古、内蒙古双峰驼进行比较。结果表明：D-loop序列中共检测到96个多态位点，定义了27种单倍型。3个青海骆驼类群占有16个单倍型，而蒙古双峰驼独有7个单倍型，内蒙古双峰驼独有4个单倍型。系统发育分析显示出两个独立的分支：第一支为青海骆驼3个类群与蒙古双峰驼，且德令哈双峰驼与其他两个类群间存在明显界限；第二支为内蒙古双峰驼。青海骆驼与内蒙古双峰驼的遗传距离均较远，但与蒙古双峰驼的遗传距离较近。因此，青海骆驼母系起源更倾向于蒙古双峰驼而非内蒙古双峰驼。

关键词 柴达木双峰驼；线粒体DNA；系统发育；遗传多样性；单倍型

青海骆驼是中国优良的地方双峰驼（Bactrian camel，Camelus bactrianus）品种之一，主要分布于青海省柴达木盆地境内的荒漠、半荒漠或半荒漠灌丛草场，是世界分布海拔最高的駱驼品种。作为当地重要的生产生活资料，青海骆驼的产肉、产绒、产乳、役用性能对于社会经济发展做出了重要贡献[1]。然而，随着饲养模式的落后、养殖收益的下降与经济转化效率的不足，青海骆驼数量迅速由1983年的28 100峰降至2015年的6 668峰[2]。此后随着品种保护工作的重视，青海骆驼数量得到了逐步的恢复，2018年已恢复至10 304峰。

关于青海骆驼的起源一直存有争议，目前较为明确的是青海土著骆驼自13世纪以来长期经历蒙古骆驼的血液渗透，形成了以蒙古骆驼为主要成分的混血种[3]。线粒体DNA（Mitochondrion DNA，mtDNA）具备严格的母系遗传特征并且在世代传递中几乎不发生重组，因此常被用于研究哺乳动物品种起源与系统发育。mtDNA D-loop区由于进化速度快、变异水平高，是最常用的种群遗传多样性研究标记之一[4-5]。多项研究利用mtDNA探讨了国内外骆驼品种的遗传多样性与种群进化关系[6-7]，然而青海骆驼的品种起源与遗传特征仍未得到充分阐明。因此，本研究借助mtDNA D-loop序列对青海骆驼的3个典型类群（都兰、德令哈、莫河）进行分析，并与蒙古、内蒙古双峰驼D-loop序列进行比较，以阐明青海骆驼不同类群及其与蒙古、内蒙古双峰驼间的进化关系，为青海骆驼资源的保护与利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品

本试验共采集88份青海骆驼耳组织样品，覆盖范围包括都兰、德令哈和莫河3个典型类群，分别采自青海省海西蒙古族藏族自治州德令哈市蓄集乡、都兰县香日德镇与乌兰县茶卡镇。样品保存于装有75%酒精的离心管中，运回实验室后于-80 ℃条件下保存。采样点及样本信息见表1。

1.2 仪器及试剂

StarSpin柱式动物DNA提取试剂盒（D111）、StarPrep快速胶回收试剂盒（D205）与  2×Taq PCR StarMix试剂盒（A012）购自北京康润诚业生物科技有限公司；Nanodrop超微量分光光度计（ND1000）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；PCR仪（A200）购自杭州朗基科学仪器有限公司。

1.3 总DNA的提取

取青海骆驼耳组织样品0.1 g，使用DNA提取试剂盒提取总DNA，并使用超微量分光光度计测定DNA浓度与质量，随后将样品浓度稀释至100 ng/μL。

1.4 D-loop序列的扩增与测序

使用引物D-loop-F（5′-ATACTGATTACG- CTGGTCTTG-3′）和D-loop-R（5′-ACTAATAGAAAGGCTGGGATC-3′）扩增mtDNA D-loop区序列片段。PCR扩增体系如下：2×Taq PCR StarMix 25.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA样品2.0 μL，最后用ddH2O补齐至50.0 μL。PCR扩增程序如下：94 ℃预变性2 min；  94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR扩增产物使用20 g/L琼脂糖凝胶电泳，观察确认目的片段后切下胶块，使用胶回收试剂盒进行回收纯化，纯化样品送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行Sanger测序。

1.5 统计分析

测序结果使用Chromas 2.6软件进行原始序列峰图检测。基于青海骆驼长期存在蒙古骆驼血液渗透的观点，自NCBI下载了蒙古与内蒙古双峰驼D-loop序列（表2），与青海骆驼测序结果汇总分析。在MEGA 7.0软件中使用MUSCLE比对序列同源性并校正，计算序列的核苷酸组成与遗传距离；使用DnaSP 5.10软件对多态位点数、单倍型数、核苷酸多样性、单倍型多样性、单倍型数、平均核苷酸差异、中性检验及遗传分化指数等进行统计。以野生双峰驼（wild Bactrian camel，Camelus ferus）D-loop序列NC_009628.2为外群，构建邻接法（Neighbor-Joining，NJ）系统发育树，并用iTOL网站（https：//itol.embl.de/）美化；使用Network 4.2软件绘制单倍型网络图。

2 结果与分析

2.1 青海骆驼D-loop序列DNA多态性分析

经PCR扩增，3个青海骆驼类群获得的D-loop序列片段与预期目的片段大小（1 300～  1 500 bp）一致，且条带单一（图1），保证了后续分析的可靠性。以野生双峰驼D-loop序列为参考，分别比对3个青海骆驼类群测序结果与蒙古、内蒙古双峰驼序列。经校正与修剪后，共获得118条长度为759 bp的D-loop序列（图2）。

序列中4种碱基（T、C、G和A）的平均含量分别为24.7%、27.9%、28.9%和18.5%，A+T含量（53.6%）高于C+G含量（46.4%），符合mtDNA D-loop区富含A/T碱基的序列特征。5个类群共检测到96个多态位点，整个群体的核苷酸多样性、核苷酸平均差异数和单倍型多样性分别为0.014 93、10.851和0.845。在3个青海骆驼类群中，都兰双峰驼具有最高的核苷酸多样性，莫河双峰驼次之，而德令哈双峰驼最低。与之对应，中性检验结果显示，都兰和莫河双峰驼TajimaD结果均为负值且显著偏离中性（P <  0.05），表明二者在形成进程中均发生过明显的种群扩张，而德令哈双峰驼群体则较为保守（表3）。

2.2 双峰驼群体历史动态分析

遗传距离与遗传分化指数分析显示，3个青海骆驼类群间的遗传距离较为接近，而都兰双峰驼与莫河双峰驼间的遗传分化指数最小，表明二者之间可能发生一定程度的基因交流（表4）。内蒙古双峰驼与其他4个类群的遗传差异均远大于蒙古双峰驼，进一步证实了青海骆驼可能与蒙古双峰驼而非内蒙古双峰驼存在更为密切的亲缘关系。

2.3 系统发育树构建与单倍型网络关系分析

为了进一步分析青海骆驼3个类群的系统发育关系，以野生双峰驼mtDNA D-loop序列为外群构建了NJ系统发育树。结果显示，所有样本明显分为两个独立的分支：第一支分支是青海骆驼3个类群与蒙古双峰驼，另一支则是内蒙古双峰驼，两支在进化上存在明显界限（图3）。

由表5可知，单倍型分析共界定了27种单倍型Hap1～Hap27。其中：都兰双峰驼有7种，德令哈双峰驼有6种，莫河双峰驼有9种，蒙古双峰驼有7种，内蒙古双峰驼有4种。27个单倍型中，Hap5和Hap8在不同双峰驼类群中出现的频率最高，在3个青海骆驼类群中均有分布。

单倍型网络分析呈现的不同类群亲缘关系与系统发育树结果基本一致。内蒙古双峰驼与其他类群之间明显存在差异，相比之下蒙古双峰驼与青海骆驼则更为接近。值得关注的是，青海骆驼3个类群间存在单倍型共享：Hap6为都兰和莫河双峰驼共享；Hap9为都兰和德令哈双峰驼共享；Hap5与Hap8则在3个类群中均有发现（图4）。

3 讨  论

厘清品种的系统进化关系与遗传多样性是家畜遗传资源保护的必要前提。围绕双峰驼的研究早期多采用细胞染色体核型分析与血液蛋白多态性分析的手段，获得的信息量有限[8-9]。近年来，借助基因组DNA测序手段与多种分子标记的辅助分析，更多的遗传信息被揭示[10]。程佳等[11]使用线粒体细胞色素b部分序列检测了5个双峰驼类群，分析表明中国家养双峰驼起源于同一母系，但与现存的野生双峰驼祖先并不相同。这一结论随后也被野生和家养双峰驼的全基因组测序结果所证实[12]。何晓红等[13]使用微卫星引物分析了10个双峰驼类群的遗传关系，证实新疆的双峰驼类群聚为一类，而青海、甘肃、内蒙古与蒙古双峰驼具有较近的亲缘关系。而另一项针对中国、蒙古与俄罗斯等多国的11个双峰驼类群进行比较的结果则证实，不同地域间的家养双峰驼类群分化特征并不明显，存在一定的基因交流[14]。

本研究基于遗传距离与遗传分化指数分析进一步表明，在家养双峰驼内部依然存在一定程度的遺传分化，青海骆驼、蒙古双峰驼与内蒙古双峰驼处于不同的进化分支。据记载，青海骆驼的起源至少有3个：早期骆驼可能随吐谷浑人、蒙古人征战由内蒙古带入青海；解放前部分哈萨克人由新疆带驼进入柴达木盆地；而解放初期青海由甘肃购进数千峰骆驼屯牧繁育于盆地[15]。本研究进一步比较青海骆驼的3个类群发现，都兰双峰驼与莫河双峰驼存在相对较多的基因交流，而德令哈双峰驼显示出与其他两个类群明显不同的分化方向。研究结果与先前研究存在一定的差异[13，16]，但与白俊艳等[17]基于表型测定结果的聚类分析相符，这可能与之前试验采用的样品数量、地理区域与分子标记选择相关。因此，还需要通过进一步研究分析青海骆驼不同起源的可能性。

4 结  论

从母源进化上看，青海骆驼与蒙古双峰驼间遗传分化程度较小，但与内蒙古双峰驼间存在较大的遗传差异，其起源可能更倾向于蒙古双峰驼而非内蒙古双峰驼。青海骆驼3个类群间存在一定的基因交流，但是德令哈双峰驼表现出与其他两个类群间明显的遗传分化。研究进一步阐明了青海骆驼的遗传多样性与系统发育关系，对于青海骆驼的品种保护与资源开发具有指导意义。

参考文献 Reference：

［1］ 张玲勤.青海骆驼亟待保护[J].中国畜牧杂志，2007， 43（5）：63-64.

ZHANG L Q.Qinghai camels need urgent protection[J].Chinese Journal of Animal Science，2007，43（5）：63-64.

[2] 艾德强，阎 萍.青海骆驼种质资源保护现状与开发利用对策[J].中国草食动物科学，2018，38（2）：68-70.

AI D Q，YAN P.Protection situation and utilization countermeasures of Qinghai camel germplasm resources[J].Chinese Herbivore Science，2018，38（2）：68-70.

[3] 贺新民.青海骆驼来源和发展的探讨——兼论羌族来源及其畜牧简史[J].农业考古，1995（1）：292-298.

HE X M.Discussion on the origin and development of Qinghai camel：also about the origin of Qiang people and their animal husbandry[J].Agricultural Archaeology，1995 （1）：292-298.

[4] 李新建，薛亚辉，王明宇，等.河南地方猪mtDNA D-loop序列遗传多样性及系统进化分析[J].河南农业大学学报，2020，54（3）：452-461.

LI X J，XUE Y H，WANG M Y，et al. Genetic diversity and phylogenetic relationships of Henan native pig breeds based on the sequence of mtDNA D-loop region[J].Journal of Henan Agricultural University，2020，54（3）：452-461.

[5] 董泽生，高 雪，吴燕华，等.藏系绵羊mtDNA和Y染色体遗传多样性的检测与系统进化关系的分析[J].黑龙江畜牧兽医，2019，568（4）：45-47，51，179.

DONG Z  SH，GAO X，WU Y H，et al.Genetic diversity and phylogenetic evolution of mitochondrial DNA and   Y-chromosome in Tibetan sheep[J].Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，2019，568（4）：45-47，51，179.

[6] MING L，YI L，SA R，et al.Genetic diversity and phylogeographic structure of Bactrian camels shown by mitochondrial sequence variations[J].Animal Genetics，2017，48（2）：217-220.

[7] 张成东，任战军，杨雪娇.苏尼特家养双峰驼mtDNA Cyt b基因和D-loop序列的遗传多样性[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2015，43（3）：32-42.

ZHANG CH D，REN ZH J，YANG X J.Genetic diversity of mtDNA Cyt b gene and D-loop sequence of Sunite domestic bactrian camel[J].Journal of Northwest A&F University （Natural Science Edition），2015，43（3）：32-42.

[8] 张才骏.青海双峰驼血液蛋白质多态性的研究[J].中国畜牧杂志，1996，32（5）：33-34.

ZHANG C J.Study on blood protein polymorphism of Qinghai Bactrian camels[J].Chinese Journal of Animal Science，1996，32（5）：33-34.

[9] BALMUS G，TRIFONOV V A，BILTUEVA L S，et al.Cross-species chromosome painting among camel，cattle，pig and human：further insights into the putative Cetartiodactyla ancestral karyotype[J].Chromosome Research，2007，15（4）：499-515.

[10] [ZK（#]明 亮，伊 丽，何 静，等.双峰驼起源与进化的分子遗传学研究进展[J].家畜生态学报，2017，38（3）：5-9.

MING L，YI L，HE J，et al.Research progress on molecular genetics of origin and domestication of Bactrian camel[J].Acta Ecologiae Animals Domastici，2017，38（3）：  5-9.

[11] 程 佳，任战军，王 乐，等.基于Cytb基因的家养双峰驼分子系统发育研究[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2009，37（12）：17-21.

CHENG J，REN ZH J，WANG L，et al.Molecular phylogeny of domestic bactrian camel revealed by partial cytochrome b gene[J].Journal of Northwest A&F University （Natural Science Edition），2009，37（12）：17-21.

[12] JIRIMUTU，WANG ZH，DING G H，et al.Genome sequences of wild and domestic bactrian camels[J].Nature Communication，2012，3：1202.

[13] 何晓红，韩秀丽，关伟军，等.采用微卫星标记分析10個双峰驼群体的遗传变异和群体间的遗传关系[J].生物多样性，2012，20（2）：199-206.

HE X H，HAN X L，GUAN W J，et al.Genetic variability and relationship of 10 Bactrian camel populations revealed by microsatellite markers[J].Biodiversity Science，2012，20（2）：199-206.

[14] MING L，YI L，GUO F C，et al.Molecular phylogeny of the Bactrian camel based on mitochondrial Cytochrome b gene sequences[J].Genetics and Molecular Research，2016，15（3）：15038983.

[15] 焦小鹿，寧金友，马清德，等.青海省畜禽遗传资源志[M].西宁：青海人民出版社，2013：104-108.

JIAO X L，NING J Y，MA Q D，et al.Genetic Resources of Livestock and Poultry in Qinghai  Province[M].Xining：Qinghai Peoples  Publishing House，2013：104-108.

[16] 柏 丽，周俊文，李新海，等.中国6个双峰驼群体微卫星遗传多样性分析[J].中国畜牧兽医，2017，44（6）：1734-1745.

BAI L，ZHOU J W，LI X H，et al.Analysis on the genetic diversity of six Bactrian camel populations in China   using microsatellite marker[J].China Animal Husbandry and Veterinary Medicine，2017，44（6）：1734-1745.

[17] 白俊艳，乌仁套迪，巴 拉，等.中国4个双峰驼品种的聚类分析[J].黑龙江畜牧兽医，2015，485（17）：236-238.

BAI J Y，WUREN T，BA L，et al.Clustering analysis of four Bactrian camel populations in China[J].Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，2015，485（17）：236-238.

Genetic Diversity of Mitochondrial DNA D-loop Region in Qinghai Camel

Abstract To evaluate the genetic diversity and maternal origin of Qinghai camel，a total of 88 ear tissue samples were collected from three distributed ecotypes of Qinghai camel.Genomic DNA extraction was performed to obtain the samples，after which the D-loop region on mitochondrial DNA was amplified and sequenced，and sequences were compared with those of Mongolian and Inner Mongolian Bactrian camels.The results showed that a total of 96 polymorphic loci were detected in D-loop sequences and 27 haplotypes were identified.There were 16 haplotypes shared by Qinghai camel.The Mongolian Bactrian camel had seven haplotypes，while the Inner Mongolian Bactrian camel had four haplotypes.Phylogenetic analysis revealed two distinct branches.The first branch consisted of three ecotypes of Qinghai camel and Mongolian Bactrian camel，with the Delingha Bactrian camel exhibiting a clear distinction from the other two ecotypes.The second branch was predominantly represented by Inner Mongolian Bactrian camel.The genetic distance between Qinghai camel and Inner Mongolia Bactrian camel was significantly greater than that between Qinghai camel and Mongolia Bactrian camel.In conclusion，the maternal origin of Qinghai camel is more closely related to Mongolian Bactrian camel than to the Inner Mongolian Bactrian camel.

Key words Qaidam Bactrian camel; Mitochondrial DNA; Phylogeny; Genetic diversity; Haplotype