基于PARP1信号通路研究芒柄花素对糖氧剥夺/复氧复糖神经元细胞损伤的影响

郁 丽,王 湄,王文秀,曹丽平,何前松1,

临床上治疗脑梗死常用溶栓恢复血供,但恢复血供后,过量的自由基攻击神经元细胞,造成缺血/再灌注损伤[1]。芒柄花素是药用植物锦鸡儿的主要活性成分-异黄酮类成分[2]。课题组前期研究显示该类成分对脑缺血损伤具有保护作用,也有研究报道芒柄花素具有抗炎、抗氧化和抗癌作用[3-4],并且在多种神经疾病中具有保护特性,如阿尔茨海默病[5]、创伤性脑损伤[6]、焦虑和抑郁[7]等。然而,芒柄花素在细胞糖氧剥夺/复氧复糖(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)损伤的作用还有待深入研究。多聚ADP核糖聚合酶1[poly (ADP-ribose) polymerase 1,PARP1]可由DNA损伤激活,能促进聚合物PAR的形成。在脑缺血再灌注大鼠模型中,抑制PARP1和凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)核易位可抑制神经细胞的死亡[8],但是,芒柄花素在PARP1信号通路的作用尚不清楚。因此,本研究通过建立OGD/R细胞损伤模型,基于PARP1通路探究芒柄花素在OGD/R损伤中的作用,为运用锦鸡儿异黄酮治疗脑缺血再灌注损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂芒柄花素(HY-N0183,MedChemExpress,美国);PARP1抑制剂PJ34(HY-13688A,MedChemExpress,美国);PARG抑制剂Ethacridine lactate(HY-B2174,MedChemExpress,美国);RIPA细胞裂解液(C1053,北京普利莱基因技术有限公司);BCA蛋白定量试剂盒(E-BC-K318-M,武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司);P53抗体(AF0879,江苏亲科生物研究中心有限公司);AIF抗体(17984-1-AP,武汉三鹰生物技术有限公司);β-Actin抗体(HC201,北京全式金生物技术有限公司);PARP1抗体(13371-1-AP,武汉三鹰生物技术有限公司);PARG抗体(DF13517,江苏亲科生物研究中心有限公司);Iduna抗体(bs-11669R,北京博奥森生物技术有限公司);Cy3 Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(AS008,武汉爱博泰克生物科技有限公司)。

1.2 细胞培养和糖氧剥夺/复氧复糖小鼠HT22神经元细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司,CL-0697)在添加10% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和1%P/S的DMEM培养基中,并在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养,每3 d更换1次细胞培养基。将HT22细胞接种24 h后进行OGD/R实验。将HT22细胞原培养基弃去,用无糖培养基洗涤数次后更换为无糖培养基,培养条件为37°C、1%O2、94%N2和5%CO2,进行糖氧剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)6 h后,更换为正常培养基在95%空气和5% CO2中37 ℃进行复氧复糖1、2、3、24 h。采用Western blot检测复氧不同时间(1、2、3、24 h)后细胞内PARP1和PARG蛋白表达情况,确定后续实验条件;确定OGD/R时间点后,设置6个组,分别为对照组、对照组+芒柄花素组、OGD/R组、OGD/R+芒柄花素组、OGD/R+PJ34组、OGD/R+PARG抑制剂组;对照组HT22细胞正常培养,不进行OGD/R处理。OGD/R+芒柄花素(10 μmol/L)、OGD/R+PJ34(10 μmol/L)和OGD/R+Ethacridine lactate(7.5 μmol/L)处理组在OGD/R后进行加入对应浓度药物进行孵育。

1.3 免疫荧光各组细胞培养结束后,细胞于培养皿中用4%多聚甲醛固定,PBS洗涤,每次5 min,PBS浸洗培养皿3次,每次5 min,移液枪吸干PBS,在培养皿内滴加5% BSA,37度封闭30 min;弃封闭液,培养皿加入的稀释好的一抗(P53、AIF,1 ∶200),4 ℃孵育过夜;PBS洗涤,加入稀释好的荧光二抗Cy3(1 ∶200),37 ℃孵育30 min,PBS浸洗培养皿3次,每次5 min;滴加DAPI避光孵育5 min,对标本进行染核,用流水冲洗多余的DAPI;用50%甘油封闭培养皿,然后在荧光显微镜(奥林巴斯CKX53倒置荧光显微镜,北京瑞科中仪科技有限公司)下观察细胞采集图像。

1.4 Western blot检测取各组细胞,弃去培养基,用RIPA裂解液提取总蛋白,12 000 r/min高速离心机4 ℃离心10 min,取上清液,BCA蛋白定量试剂盒对总蛋白进行定量。对蛋白样品进行变性后,进行十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)1.5 h,后用300 mA恒流转膜1 h。PVDF膜(Merck millipore)用脱脂奶粉封闭后,与一抗(AKT、p-AKT、PARP1、PARG、Iduna)4 ℃孵育过夜,次日PVDF膜室温孵育二抗2 h,用发光液浸湿PVDF膜,置于超高灵敏度化学发光成像系统中进行显影。使用Image J软件用密度法定量蛋白条带灰度值,计算目的蛋白与内参蛋白(β-Actin)灰度值的比值均值或磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白灰度值的比值均值,进行半定量统计分析。

2 结果

2.1 OGD/R可诱导HT22细胞PARP1通路激活为了评价OGD/R对HT22细胞PARP1通路的影响,采用Western blot检测复氧不同时间(1、2、3、24 h)后细胞内PARP1和PARG蛋白表达情况。如图1所示,在小鼠神经元HT22细胞中,与对照组相比,进行糖氧剥夺6 h后再进行复氧复糖培养1、2、3 h细胞中PARG表达升高(P<0.05),复氧复糖培养3 h和24 h时细胞中PARP1表达升高(P<0.05)。综合来看,在OGD/R 3 h时,HT22细胞中PARP1/PARG通路激活最明显,后续实验条件确定为OGD/R 3 h。

图1 Western blot检测HT22细胞OGD/R不同时间PARP1和PARG蛋白表达水平

2.2 芒柄花素及PARP1通路抑制剂处理对HT22细胞OGD/R损伤后P53和AIF表达影响免疫荧光结果如图2所示,DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色,阳性表达为相应荧光素标记的红光。与对照组相比,芒柄花素组细胞中p53和AIF表达无明显差异变化,OGD/R组细胞中p53和AIF表达均升高(P<0.05);而在OGD/R后加入芒柄花素、PARP1抑制剂PJ34、PARG抑制剂Ethacridine lactate孵育后,HT22细胞中AIF、p53表达下降。这表明芒柄花素、PARP1抑制剂PJ34、PARG抑制剂Ethacridine lactate均可降低OGD/R诱导的神经元细胞中AIF、p53表达(免疫荧光量化分析见图3)。

图2 免疫荧光检测HT22细胞P53、AIF蛋白表达情况 ×400

图3 免疫荧光检测HT22细胞P53、AIF蛋白表达差异性分析

2.3 芒柄花素对HT22细胞OGD/R损伤后PARP1通路的影响如图4所示,与对照组相比,HT22细胞经OGD/R后,细胞中AKT蛋白磷酸化比值下降(P<0.05),Iduna蛋白表达下降(P<0.05),PARG和PARP1蛋白表达量升高(P<0.05)。与OGD/R组细胞相比,在OGD/R后加入芒柄花素或PARG抑制剂Ethacridine lactate孵育后,细胞中AKT蛋白磷酸化比值上升(P<0.05),Iduna蛋白表达上升(P<0.05),PARG和PARP1蛋白表达量均下降(P<0.05);细胞OGD/R后加入PARP1抑制剂PJ34孵育,细胞中p-AKT和Iduna蛋白表达量上升(P<0.05),而PARG和PARP1蛋白表达量均下降(P<0.05)。这表明芒柄花素可通过抑制PARP1/PARG通路对OGD/R诱导的神经元损伤进行保护。

图4 Western blot检测芒柄花素对HT22细胞OGD/R损伤后PARP1/PARG通路蛋白表达影响

3 讨论

本研究中,PARP1在OGD/R诱导的神经元损伤的调控中发挥了关键作用。PARP1及PARG在OGD/R条件下均上调,在复氧复糖3 h时达到高峰,但在24 h,PARG表达发生回降。在OGD/R后使用芒柄花素、PARP1抑制剂PJ34或PARG抑制剂Ethacridine lactate孵育细胞,均可有效抑制HT22细胞OGD/R损伤后凋亡因子P53和AIF表达,并抑制PARP1信号通路相关蛋白表达。表明芒柄花素可通过抑制PARP1信号通路参与HT22小鼠神经元细胞凋亡的调控。

PARP1是多聚ADP核糖聚合酶的一种,主要负责DNA链缺口和断链轻度激活后染色体DNA修复,然而,过度活化的PARP1可以将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)转化为长PAR聚合物,从细胞核转移到细胞质后产生细胞毒性作用,PAR聚合物可诱导AIF从线粒体外膜池释放,加剧细胞凋亡的联级反应,同时多聚ADP核糖甘油水解酶PARG将ADP核糖从蛋白上降解[9]。PARP1在缺血再灌注表达后上调,抑制PARP1信号通路对缺血再灌注损伤具有保护作用[10]。在本研究中,OGD/R诱导的HT22小鼠神经元细胞中PARP1在复氧复糖3、24 h后均升高,PARG在OGD/R条件下以时间依赖性上调,但在24 h表达下降(图1),故本研究选择OGD/R 3 h作为后续研究实验条件。另外,本研究中在OGD/R条件下,HT22细胞中除了PARP1和PARG被激活,凋亡诱导因子AIF和P53表达升高,而芒柄花素与PARP1抑制剂PJ34和PARG抑制剂Ethacridine lactate效果一致,均抑制了PARP1和PARG,同时部分逆转了AIF和P53的累积,而挽救了细胞的凋亡。这表明芒柄花素可通过抑制PARP1和PARG激活而抑制OGD/R诱导的HT22小鼠神经元细胞发生凋亡。

Iduna是一种PAR聚合物依赖的E3泛素连接酶,调节DNA损伤,Iduna对PARP1的OAR依赖泛素化靶向其进行蛋白酶体降解,通过PAR结合和泛素E3连接酶活性,Iduna保护细胞免受DNA损伤剂诱导的细胞死亡[11]。Iduna可通过抑制PARP1诱导的细胞死亡来保护HT22细胞免受过氧化氢诱导的氧化应激[12]。本研究显示在OGD/R条件下,HT22细胞中Iduna蛋白表达水平下降,经芒柄花素或PARG抑制剂Ethacridine lactate孵育后可部分逆转,但PARP1抑制剂PJ34却没有这种效果。这表明芒柄花素是通过上调Iduna来抑制OGD/R诱导的PARP1表达而减轻HT22小鼠神经元细胞损伤。

有研究[13]说明芒柄花素通过激活AKT磷酸化蛋白介导对大鼠脑缺血/再灌注的神经保护作用,本研究结果与之一致。本研究显示芒柄花素处理OGD/R后的HT22细胞可升高p-AKT蛋白磷酸化比值,同时,在此研究中,PARP1抑制剂PJ34和PARG抑制剂Ethacridine lactate处理可使OGD/R后的HT22细胞中p-AKT比值升高。这表明芒柄花素可通过抑制PARP1通路来激活AKT的磷酸化而抑制OGD/R诱导的HT22细胞凋亡。

综上所述,本研究结果显示HT22小鼠神经元细胞在OGD/R条件下,芒柄花素可通过提高Iduna蛋白表达抑制PARP1/AIF/Akt信号通路来减轻HT22小鼠神经元细胞损伤。这些结果为开发运用锦鸡儿异黄酮治疗脑缺血再灌注损伤提供了依据,后续可在体内动物模型研究中进一步证明这一机制,以排除体外研究的局限性。