老年慢性心力衰竭病人血清微RNA-21、白细胞介素-6、脑利钠肽水平与预后的关系研究

侯杰，王丽芳，李园春，刘勇，姚海涛

作者单位：1唐山中心医院急诊科，河北 唐山063008；2唐山市丰南区医院内科，河北 唐山063300；3盐山县人民医院内三科，河北 沧州061300

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是指病人由于心肌梗死、炎症或血流动力学负荷过重等各种原因导致心肌细胞损伤，功能丧失，心肌收缩/舒张力减弱，心脏的搏出量不能满足机体代谢需要而引起的一系列临床综合征，是各种心脏疾病的终末期［1-2］。临床表现为全身乏力、呼吸困难及体液潴留等。CHF病人病情复杂，危险性高，预后差。所以尽早对病人的预后作出评价，对预后不良的病人可实现干预措施前移，避免或延缓心血管事件的发生。美国心脏病学会/美国心脏协会（ACC／AHA）心衰指南根据CHF的严重程度分为四个阶段，但这四个阶段的划分对预后的预测价值不高。目前临床虽有一些与CHF有关指标对预后的评估有一定的作用，但至今为止仍未形成共识。因此寻找新的、有价值的标志物对CHF的诊治有积极的意义。随着研究的深入，临床已公认CHF是一种多层次、多系统功能改变，或多分子、基因功能衰竭交互作用的结果，这些交互作用变化包括胚胎蛋白和基因的再表达，心肌细胞肥大、凋亡等变化。近年来的研究已证实心室重构的发生与进展与过度表达的活性分子有关，其中细胞因子平衡失调及神经内分泌系统紊乱在心室重构的进程中起着重要作用［3］。同时心室重构是一个“进展性”过程，心肌细胞在多种病因的作用下功能形态会逐渐趋于异常，直至CHF症状出现并进展至终点事件-死亡，这是一个持续进展的过程。脑利钠肽（BNP）是Sudoh在上世纪八十年代从猪脑中发现的由心室合成的一种循环激素，现有的研究已证明心室容量或压力负荷增加时，BNP水平会随之升高［4］，说明BNP参与了CHF的发生和进展。但单一指标灵敏度和特异度较低。近年来研究发现，血清微RNA-21（miRNA-21）在急性心肌梗死病人中的表达异常升高［5］。白细胞介素-6（IL-6）可通过各种机制引起心功能不全。目前国内外相关文献对于BNP、IL-6与CHF危险分层及预后关系的研究较多，但miRNA-21与CHF预后关系的研究研究较少，尚无血清miRNA-21、IL-6、BNP与CHF预后关系的研究。本研究根据是否发生CHF再次入院和全因死亡分组，比较两组血清miRNA-21、IL-6、BNP水平，并分析水平变化与预后的关系，为临床提供理论依据，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象为唐山中心医院2020年1月至2021年1月住院的老年CHF病人，选择其中符合以下入排标准的120例病人为本研究样本。研究样本均随访至2022年1月31日，以发生CHF再入院、全因死亡为终点事件，发生终点事件的46例病人为预后不良组，年龄范围60～79岁；未发生终点事件的74例病人为预后良好组，年龄范围60～78岁；两组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。本研究方法均告知病人或近亲属，其知情同意并签署知情同意书，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

表1 两组老年慢性心力衰竭（CHF）病人一般资料比较

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：①符合中华医学会心血管病学分会《中国心力衰竭诊断和治疗指南2014》中CHF诊断标准，年龄≥60周岁；②CHF病史≥6个月。

排除标准：①合并肾功能并不全者、甲状腺疾病及免疫性疾病者；②合并恶性肿瘤者；③急性心肌梗死及呼吸衰竭病人；④入院前1周使用过激素、免疫抑制剂等影响检测指标药物者。

1.3 方法

1.3.1 实验室相关指标检测 采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测IL-6、BNP水平；miRNA-21采用实时荧光定量技术，先用Trizo1法对总RNA进行抽提和纯化，纯度符合要求后按以下步骤操作：①以cDNA为模板行荧光定量PCR，采用大连宝生物TaKaRa公司的荧光定量PCR试剂盒；②以总RNA为模板行逆转录反应；③PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳检测；④采用相对定量方法，以miR39为外参基因，计算3次，取平均值作为血清miRNA-21值。

1.3.2 超声检测 所有病人均于入院24 h内行心脏超声检查，检测左室射血分数（LVEF）、左心室舒张末期内径（LVEDD）。

1.4 统计学方法 使用EXCEL 2016进行数据汇总，使用SPSS 23.0进行研究资料分析。研究资料中的计量数据，均通过正态性检验，以描述，两组间的比较为成组t检验或校正t'检验。计数资料以例（%）描述，两组比较为χ2检验或校正χ2检验。此外，影响因素分析及多指标联合应用之预测评估模型的建立采用多因素非条件logistic回归。预测诊断评估效能分析为受试者操作特征（ROC）曲线分析。统计检验水准α=0.05，均为双侧检验。

2 结果

2.1 两组心功能比较 预后良好组与预后不良组心功能分级差异有统计学意义（P＜0.05）。预后良好组LVEF高于预后不良组，LVEDD低于预后不良组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组老年慢性心力衰竭（CHF）病人心功能分级及LVEF、LVEDD比较

2.2 两组血清miRNA-21、IL-6、BNP水平比较预后良好组血清miRNA-21、IL-6、BNP水平均低于预后不良好组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 老年CHF病人预后良好组与预后不良组病人血清miRNA-21、IL-6、BNP水平比较/

表3 老年CHF病人预后良好组与预后不良组病人血清miRNA-21、IL-6、BNP水平比较/

注：CHF为慢性心力衰竭，miRNA-21为血清微RNA-21，IL-6为白细胞介素-6，BNP为脑利钠肽。

BNP/（ng/L）524.99±39.82 1 963.58±85.73 106.87＜0.001组别预后良好组预后不良好组t值P值例数74 46 miRNA-21 0.52±0.08 1.19±0.13 31.45＜0.001 IL-6/（µg/L）71.46±10.57 139.75±19.76 21.60＜0.001

2.3 CHF病人预后不良的影响因素分析 为探讨CHF病人预后不良的影响因素，建立非条件logistic回归模型。以本研究资料为样本，以CHF病人预后为应变量，赋值预后不良（发生CHF再入院或全因死亡）=1，预后良好=0。以心功能指标及血清miRNA-21、IL-6、BNP水平作为自变量。其中，心功能3个指标互有较强的共线相关关系，经临床和统计人员会商，只选择LVEF指标。回归过程采用逐步后退法，以进行自变量的选择和剔除，设定α剔除=0.10，α入选=0.05。

回归结果：心功能（LVEF）指标及三个血清指标（miRNA-21、IL-6、BNP）均被保留入回归模型，P＜0.05，OR＞1，即它们均是CHF病人预后不良的危险因素。见表4。

表4 心功能LVEF及血清miRNA-21、IL-6、BNP水平对老年慢性心力衰竭（CHF）预后影响的logistic回归结果

2.4 血清miRNA-21、IL-6、BNP水平对CHF预后的预测评估效能分析 进一步探讨血清miRNA-21、IL-6、BNP等三指标对CHF预后的预测评估效能：以预后不良组为阳性样本（n=46），以预后良好组为阴性样本（n=74），建立ROC预测分析模型。

单独应用：各指标均参考临床实践划分成若干个组段，再以软件拟合之ROC曲线读取约登指数最大值点，对应计算理论阈值和各项参数。并按实测样本计算敏感度、特异度、准确度。

联合应用（LogP模式）：以前述logistic回归结果，建立血清miRNA-21、IL-6、BNP等三指标联合应用的预后风险评估/预测模型，以其Log（P/1-P）=1.020×miRNA-21+0.048×IL-6+0.016×BNP为联合应用的虚拟概率量指标，再行ROC分析。

分析结果显示：联合应用诊断效能很高，AUC及灵敏度、特异度、准确度均较各单独应用指标有明显提升。见表5。

表5 血清miRNA-21、IL-6、BNP对老年慢性心力衰竭（CHF）病人预后的预测价值

3 讨论

3.1 血清BNP水平与预后的关系 大量的研究已证实机体神经内分泌系统在心功能出现异常之初就已被激活，并参与心肌重构［6］。同时神经内分泌系统激活后，随着时间的延长，并在血流动力学等因素的相互影响下加速心功能的进一步恶化，心室的适应性逐渐降低，最终进展为有症状的CHF。而作为心血管神经内分泌系统标志物之一的心脏肽类物质首先引起了临床的高度关注。研究发现，当心室容量或压力负荷升高时，BNP水平会随之高，其主要作用是拮抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统［7］。大量研究已证实，CHF病人BNP水平高于健康人群，且CHF病人病情越严重，BNP水平越高［8］。Maisel等［9］分析了LVEF与BNP水平的相关性，结果显示，LVEF与BNP水平呈显著负相关（r=-0.46，P＜0.05）。本研究结果显示，预后良好组血清BNP水平低于预后不良好组，差异有统计学意义（P＜0.05）。且预后良好组LVEF高于预后不良组，LVEDD低于预后不良组，差异有统计学意义（P＜0.05），与Maisel等研究结果基本相符。提示随着BNP水平升高，CHF病人心功能状态越差。而进一步的logistic回归分析显示，CHF病人较高的BNP水平是预后不良的危险因素，故BNP指标对病人预后的评估及治疗有一定的指导价值。

3.2 血清IL-6水平与预后的关系 细胞因子是由免疫和非免疫细胞分泌合成的小分子多肽，作用是调节细胞生理功能。IL-6是调节炎性和免疫反应的多功能细胞因子，单核细胞、血管内皮细胞、吞噬细胞及T2淋巴细胞等激活后均可产生IL-6。近年来有研究发现，CHF病人的死亡还与促炎细胞因子水平升高有关［10］。另有研究［11］显示，高IL-6水平的CHF病人病死率高于低IL-6水平的病人，差异有统计学意义。认为IL-6可结合心肌成纤维细胞与心肌细胞上的受体，增加一氧化氮（NO）的合成，诱导心脏纤维化和肥大致舒张功能障碍。另有动物实验研究［12］显示，IL-6通过Janus激酶-信号转导和转录激活因子（STAT3）途径抑制左室乳头肌收缩功能，认为IL-6介导的负性肌力作用是通过促进心肌合成N0而实现的，随着心功能不全的加重，血清IL-6水平呈进行性增高。因此，检测血清IL-6水平可间接反映CHF病人的血流动力学紊乱，并可作为预后预测的独立指标。本研究结果显示，预后良好组血清IL-6水平低于预后不良好组，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步logistic回归分析显示：较高水平的IL-6，也是CHF病人预后不良的危险因素。故血清IL-6有一定的预测CHF病人预后的评估效能，此点亦为本研究的ROC分析结果所证实。

3.3 血清miRNA-21水平与预后的关系 MicroRNA（miRNA）是一类内生的微小RNA，早期的临床研究发现，miRNA-21在多个器官恶性肿瘤中呈高表达，因此一直将其视为致癌性物质。近年来miRNA-21在心血管疾病上的作用受到临床的普遍关注［13］。有文献报道［14］，miRNA几乎参与了包括心肌缺血、冠状动脉狭窄、心肌肥厚、CHF等所有心血管疾病的病理过程，而miRNA-21在其中参与了多个细胞信号转导通路的调控。近年来研究发现，miRNA-21可外周血中可稳定存在，并在急性心肌梗死病人中的表达异常升高［14-15］，提示其可能成为心血管疾病病人的又一敏感指标。本研究结果显示，预后良好组血清miRNA-21水平低于预后不良好组，差异有统计学意义（P＜0.05）。logistic回归分析显示，较高水平的miRNA-21，是CHF病人预后不良的危险因素。基于此建立的ROC曲线，证实血清miRNA-21预测CHF病人预后的AUC在单一指标中预测价值最高。究其原因可能是当心脏负荷增加时，会上调miRNA-21表达，并激活纤维化基因程序，促进心肌细胞纤维化［16-18］。

最后，本研究结果显示，血清miRNA-21、IL-6、BNP联合预测CHF病人预后的AUC 95%CI为0.86（0.77，0.94），Youden为0.69，均远高于3种指标的单独应用。此结果提示该联合应用方法，能有效地用于CHF的早期诊断和预后评估，为CHF病人的靶向治疗提供新思路。当然，本研究由于样本量较少，研究结果可能存在偏差，后期将扩大样本，对研究结果进一步证实。