外泌体非编码RNA调控骨质疏松症研究进展

郝茂辰 王磊 冬梅 王建忠

1.内蒙古医科大学,内蒙古 呼和浩特 010000

2.内蒙古医科大学第二附属医院,内蒙古 呼和浩特 010000

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是全球最常见的慢性疾病之一,其主要特征为骨量减少、骨脆性增加及骨微结构破坏[1-2],老年人骨质疏松症的患病率高,在中国65岁以上人群中的患病率为32%,是老年人致残和致死的主要原因之一[3]。目前临床上使用的骨合成代谢剂和骨吸收抑制剂治疗OP的效果有限,因此需要探索新的治疗方法[4-6]。

外泌体是由胞内主动分泌到胞外的纳米级囊泡微粒,包裹着包括蛋白质、核糖核酸和脂质在内的多种生物活性物质,主要负责细胞间信号传导[7-9]。外泌体来源丰富,在局部骨微环境中可调节相关骨细胞的增殖分化,是治疗OP的潜在途径[10-11]。约70%的人类基因组可以转录,其中仅有1%～2%编码蛋白质,而剩下的98%则为非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)[12]。根据其功能可以分为管家RNA[如rRNA(ribosomal RNAs,rRNAs)、tRNA(transfer RNAs,tRNAs)、snRNA(smallnuclear RNAs,snRNAs)、snoRNA(smallnuclear RNAs,snRNAs)等]和调节RNA[如miRNA(microRNAs,miRNAs)、circRNA(circular RNAs,circRNAs)、lncRNA(long noncoding RNAs,lncRNAs)、siRNA(small interfering RNAs,siRNAs)等][13-14]。目前,因ncRNA在骨细胞增殖、分化、成熟和死亡等方面发挥重要作用,针对ncRNA在骨细胞微环境中的研究逐渐成为热点。

本文详细阐述了外泌体来源的ncRNA在OP中研究现状,对未来ncRNA靶向治疗OP研究方向及临床转化提供了理论基础。

1 外泌体miRNA与骨质疏松症

miRNA的序列长度通常为19～23个核苷酸,可以与RNA诱导的沉默复合物中的靶mRNA的3’UTR结合,并抑制mRNA的翻译和/或稳定性,从而抑制蛋白质的表达。miRNA参与许多细胞功能的调节,如细胞凋亡、脂质代谢和细胞分化等[15-16]。OP的特征是由于骨吸收和骨形成之间的不平衡而导致的进行性骨丢失和微观结构破坏[17-18]。近年来,在成骨细胞前体、成骨细胞、破骨细胞前体和破骨细胞中发现的一些外泌体miRNA,已被证实可以通过调节成骨细胞和破骨细胞的分化和信号传递来介导骨重塑[13,19]。外泌体miRNA因其在OP患者血清中的差异调节作用而逐渐被视为OP的重要生物标志物[20]。

1.1 外泌体miRNA与老年型骨质疏松症

随着机体衰老,衰老细胞分泌相关表型的分子到骨微环境中。这些成分可能在骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)和破骨细胞之间传递信号,从而调节骨重塑[21]。这被认为是老年型骨质疏松症骨丢失的主要原因,且众多研究表明miRNA可能起主要作用。与此同时,外泌体分泌到细胞外环境后,能将分泌物运送到靶细胞,保护分泌物在运输过程中不被降解[22]。因此,BMSCs和破骨细胞之间的相互作用可能依赖于外泌体miRNA在骨髓微环境中的穿梭,进而调节骨重塑[23]。

Li等[21]研究了骨代谢相关的miRNA在老年骨折妇女和老年去卵巢(ovariectomized,OVX)小鼠的骨标本和血清外泌体中的表达,表明破骨细胞中与血清中外泌体miR-214-3p水平的升高和骨形成减少有关。在体内外实验证明破骨细胞来源的外泌体miR-214-3p可以转移到成骨细胞,抑制成骨细胞的骨形成。此外,实验表明破骨细胞靶向抑制miR-214-3p治疗可以促进衰老OVX小鼠的骨形成,这提示了一种miRNA介导的破骨细胞与成骨细胞通讯模型,用于维持局部骨环境的稳态[18,24-25]。

Xu等[26]首次报道miR-31a-5p通过促进衰老相关异染色质病灶的形成来机械调节细胞衰老。其结果表明,miR-31a-5p上调,老龄大鼠的BMSCs显示出成骨减少和衰老表型增加。此外,Xun等[27]研究表明老年骨质疏松症大鼠BMSCs的成骨分化在疲劳负荷后降低,这种降低可以通过高表达miRNA-19b-3p的年轻大鼠血清外泌体得到改善。Lu等[28]发现衰老成骨细胞来源的外泌体miR-139-5p可促进衰老和凋亡,并通过靶点TBX1抑制血管内皮细胞的增殖和迁移。Hu等[25]的研究报道了一种新型的杂化纳米粒子,该纳米粒子是将高表达C-X-C基序趋化因子受体4外泌体和携带antagomir-188的脂质体结合而成。这种杂化纳米粒子能够特异性地聚集在骨髓中并释放antagomiR-188,从而促进BMSCs的成骨并抑制其成脂,逆转小鼠年龄相关的小梁骨丢失并降低皮质骨孔隙率。

1.2 外泌体miRNA与废用型骨质疏松症

废用型骨质疏松症(disuse osteoporosis,DOP)是由机体骨骼机械刺激减少,骨微环境抵抗能力降低而引起的一种OP[29]。Yang等[7]研究表明外泌体miR-1263通过直接靶向受体细胞中的Mob1发挥其功能,抑制Mob1逆转后肢去负荷诱导的BMSCs的凋亡效应。在体内,人脐带血间充质干细胞外泌体应用于DOP模型,以验证其益处。此外,陈志浩等[30]研究发现一种力学敏感的miR-138-5p。其在不同力学条件下通过靶向微管微丝交联因子1(MACF1)和wntβ-catenin信号通路负调控成骨细胞分化和骨形成。实验结果显示,在miR-138-5p高表达的转基因小鼠和老龄小鼠中,单独的力学加载(跑步)对成骨的增加效果并不明显,而当跑步的同时注射miR-138-5p抑制剂后,转基因小鼠和老龄小鼠的成骨能力明显增加。由此可见,miR-138-5p抑制剂可作为力学增敏剂为治疗废用型或老年性骨质疏松提供新的策路。

1.3 外泌体miRNA与绝经后骨质疏松症

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是由于女性绝经后雌激素减少导致成骨细胞减少,破骨细胞增加而引起的骨质疏松[31-32]。研究表明,外泌体可以提高骨细胞对于雌激素的敏感性并促进骨再生[33]。Luo等[34]发现骨髓基质细胞外泌体(bone marrow stromal cell-derived exosomes,STExos)在体外显著增强BMSCs的成骨分化,然而,在OVX诱导的PMOP小鼠模型中,静脉注射STExos在改善骨质疏松表型方面效率低下,由于STExos表面与骨髓基质细胞特异性适配体结合,适配体将STExos递送到骨髓基质细胞中。静脉注射STExo-适配体复合物可增强OVX小鼠的骨量,并加速股骨骨折小鼠模型的骨愈合。这些结果证明了骨髓基质细胞特异性适配体功能化STExos靶向促进骨再生的有效性。此外,叶庆元等[35]研究表明供体(mesenchymal stem cells,MSCs)来源的外泌体可通过转运miR-26a恢复鼠雌激素缺乏骨质疏松模型 MSCs功能并缓解骨质疏松。

1.4 外泌体miRNA在骨质疏松中症的其他作用

局部血液供应或血管生成减少在OP中起着重要作用[9,24,36-37]。研究表明,老年小鼠和OVX小鼠的H型血管数量明显减少,这些小鼠通常患有OP[38]。Wang等[39]研究表明膝关节负荷通过增强H型血管的形成和下调外泌体miR-214-3p来促进血管生成。血管内皮细胞分泌的外泌体相比于BMSCs等具有更强的靶向性和更低的毒性。Song等[38]研究通过外泌体miRNA测序显示,在经血管内皮细胞外泌体(endothelial cell-secreted exosomes,EC-Exos)处理的骨髓巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs)中,miR-155高表达。EC-Exos中的miR-155水平远高于BMMs和ECs,表明miR-155是EC衍生囊泡的内源性载物。阻断BMMs miR-155水平逆转了EC-Exos对破骨细胞的抑制,证明了外泌体miR-155可能具有OP的治疗潜力。综上,EC-Exos可作为骨靶向和无毒的纳米药物治疗骨吸收障碍。

此外,Wei等[8]发现过表达miR-424-5p的外泌体通过WIF1/Wnt/β-连环蛋白减弱成骨发育。Li等[17]研究表明BMSCs来源的外泌体通过海马信号通路转移miR-186促进OVX大鼠成骨。Zhang等[40]研究表明来源于BMSCs的外泌体携带miR-935,通过靶向STAT1促进成骨细胞增殖和分化。Qiu等[41]研究表明BMSCs来源的外泌体miR-150-3p可以上调Runx2、Osterix这些成骨因子来刺激成骨细胞的增殖和分化。Yu等[5]研究发现M1巨噬细胞衍生的外泌体miR-98通过下调双特异性磷酸酶1和激活JNK信号通路加重骨丢失。以上研究均为OP的治疗和预防提供了潜在的靶点。

2 外泌体lncRNA与骨质疏松症

lncRNA具有转录调节、表观遗传学调节、细胞周期调节等多种功能,具有疾病预测与诊断能力[42-44]。Liu等[45]报告了约1 500个lncRNA在骨质疏松情况下差异表达,其中约250个lncRNA表现出显著差异[46]。因此,有必要对外泌体lncRNA对OP成骨细胞和破骨细胞的分化进行深入研究。

Yang等[47]研究表明BMSCs来源的外泌体lncRNA-MALAT1可能通过充当miR-34c海绵使SATB2表达上调,从而增强小鼠模型的成骨活性并缓解OP。此外,Cui等[48]研究发现内皮祖细胞衍生的外泌体LncRNA-MALAT1也可以通过充当miR-124海绵来上调整合素亚单位β1的水平,增强破骨细胞前体的募集和分化,促进体内骨修复。洪宇桁等[4]和樊萍等[49]研究均表明lncRNA-NEAT1的表达在成骨分化过程中显著下调,而在破骨分化过程中显著上调,提示lncRNA-NEAT1的表达可通过诱导破骨细胞分化和抑制成骨细胞分化导致OP的发生。

上述研究为OP的发病机制提供了更广泛的思路,lncRNA可能作为预测及判断预后的指标以及相关治疗的潜在生物靶点,为OP 的预防和诊断提供理论指导。

3 外泌体cicrRNA与骨质疏松症

cicrRNA是一类新的内源性共价连接的核糖核酸分子,没有5’～3’极性或多聚腺苷酸尾。因其特殊的环状结构,cicrRNA对核酸外切酶有很高的耐受性,这使得它们可以作为疾病中的特殊分子标记物。现在多项实验数据表明cicrRNA的失调与OP有关。Yu等[50]研究发现共有387个circRNA在OP中差异表达。例如,Zhi等[51]研究表明血清/血浆中的has-circ-0002060在OP患者中显著上调,并与低骨密度相关。此外,has-circ-0006859通过激活miR-431-5p上调ROCK1,抑制成骨细胞分化,促进BMSCs的成脂分化。该研究提示has-circ-0006859可作为检测OP和疾病进展的潜在生物标志物,并有望成为DMOP的治疗靶点。

此外,Cao等[52]研究表明外泌体circ-Rtn4通过海绵化miR-146a减弱了肿瘤坏死因子-α (TNF-α)诱导的小鼠MC3T3-E1细胞的细胞毒性和凋亡。Liu等[32]研究表明外泌体circHmbox1可能通过与miR-1247-5p结合抑制RANKL诱导的破骨细胞分化,参与TNF-α对DMOP骨代谢的调节。由此可见,研究circRNA在骨骼细胞中的表达调控以及外泌体circRNA的产生对于OP的诊断、预防和治疗有重要意义。

4 总结与展望

目前对外泌体ncRNA的研究主要集中在miRNA,对lncRNA及circRNA的研究较为局限,但已有研究均显示出了其在肌肉骨骼疾病中的意义。因外泌体可以保护ncRNA免受核糖核酸酶的影响,提高其稳定性,外泌体携带的ncRNA显示出作为理想的临床生物标志物的巨大潜力。与其他疗法相比,基于外泌体的疗法更具优势,包括无创或侵入性小、无细胞、效率高、可用于筛查以及无明显免疫原性和致瘤性等。此外,外泌体在通过骨组织工程治疗OP方面具有强大的潜力。在骨组织工程中,负载材料的外泌体在骨折后OP中显示出了独特的优势。

但目前分离能力有限,只能获得低产量和低纯度的外泌体。而且外泌体中复杂的多种物质在细胞通讯中的确切作用尚未明确。并且多数关于外泌体形成的ncRNA在肌肉骨骼疾病中的治疗应用的证据是基于体外研究,而体内甚至临床前研究更可靠,需要在未来继续进一步去验证。随着 ncRNA,尤其是circRNA、lncRNA 研究的不断深入,未来利用外泌体携带ncRNA 对OP相关骨细胞特定基因实现表达多点调控、协调骨重塑进程、延缓病情进展将有进一步突破。