基于Notch 通道右归丸对大鼠退变椎间盘的影响△

马涉，刘侃，杨敬言，黄仁俊，于栋*

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029）

椎间盘退行性变（intervertebral disc degeneration,IDD）可引起多种临床症状，也是导致退变性脊柱侧弯症、椎间盘突出症等疾病的重要原因之一，因此治疗或者延缓IDD 的研究具有十分重要的现实意义［1～3］。当前国内外医学领域对于IDD 的治疗研究并未完全成熟，在治疗方面仍有局限，尤其是针对已经出现早期退变的椎间盘，目前仍没有很好的预防和控制方法。在IDD 早期，临床中常采用保守疗法，通过服用抗炎止痛的药物和物理疗法来改善症状，但是这种方法疗效并不持久，且长期服用药物可能会导致胃肠道症状等不良反应［4］。晚期通常采取外科手术治疗，虽然能快速缓解病痛，但依然无法彻底治愈，甚至因手术造成的结构损害会使邻近椎体关节的退化更为迅速［5，6］。鉴于此，对该病的发病机理进行深入研究，针对关键环节探索药物所发挥的作用，对于预防和延缓IDD 的发生具有显著意义。

祖国医学对于IDD 也有较深的认识，阳气不足被认为是组织退变、修复能力不足的重要内因，温阳法代表性经方右归丸被广泛用于椎间盘退行性疾病的诊疗，其治疗的作用不仅仅在于减轻症状，也在于它可恢复人体的正气、提高免疫力、促进人体的自身修复，达到预防和控制病情的作用，治疗效果显著，患者症状改善明显，而且复发率较小。但其内在作用机理仍不清晰。而Notch 通路及炎症因子对IDD 的发生和发展有着密切的关系［7，8］，因此，本次研究选择与炎症反应密切相关的代表性因子白细胞介素10（interleukin 10,IL-10）、巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor,MIF）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α），基于Notch 通路选择特异性蛋白Notch1，及细胞外基质中的重要组成部分II 型胶原作为研究重点进行进一步研究，旨在观察右归丸对大鼠椎间盘退行性变模型的影响，以期探讨右归丸治疗IDD 的内在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组

使用由中国中医科学院医学实验中心提供的体重为（220±30）g、年龄为6～8 周的健康雄性SD 品系大鼠（SPF 级） 30 只，动物生产许可证号［SCXK（京）2021-0011］。随机分为正常对照组10 只、退变组10 只、药物组10 只。实验期间，需要保证大鼠饲养环境温度为23℃～25℃，湿度保持在50%～65%，供应标准鼠粮，适应性饲养1 周后进行实验。本次实验经本校伦理部门审核批准，过程符合3R 原则。

1.2 实验处理

正常对照组：正常对照组为健康大鼠，不做特殊处理。

退变组：退变组采用纤维环穿刺法制作IDD 模型［9］。大鼠适应性饲养1 周。术前，大鼠禁食水12 h，并称重。随后以体重为依据，通过腹腔注射，给予1.5 ml/kg 的3%戊巴比妥钠，麻醉生效后，需要将目标节段的脊柱区毛发全部剃除，清洁后仰卧固定，消毒后铺巾，于前正中线右侧旁开0.5 cm 处做纵行切口，暴露腹后壁，保护腹腔脏器及血管，从脊柱附着点上，缓慢剥离腰大肌，暴露L4/5、L5/6椎间盘（髂嵴平对L5/6椎间盘或L6椎体），在确定环状纤维后，使用注射器挑破纤维环。穿刺成功后，通过检查确保脏器无出血、腹膜完整，逐层关闭肌肉、筋膜和皮肤等创口，对伤口处进行碘伏消毒，并涂抹适量的头孢呋辛钠以预防感染，术闭。

药物组：在退变组基础上予右归丸灌胃，根据“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值”，标准成人体重（70 kg）与大鼠体表面积折算的等效中剂量比率换算后，右归丸用量约为10.5 g/kg［10］，1 次/d，上午10 点给药。右归丸药物组成：熟地黄24 g，鹿角胶、山药、杜仲、菟丝子各12 g，山茱萸、当归、枸杞子各9 g，附子、肉桂各6 g，购自北京中医药大学第三附属医院药剂科，煎煮并制成浓度为2 g/mL 的右归丸药液，于4℃冰箱保存［11］。

1.3 检测方法

1.3.1 动物处死与样本采集

手术及实验期间，各组大鼠无感染、死亡等情况。2 周后，依据实验鼠体重，按1.5 ml/kg 的标准腹腔注射3%戊巴比妥钠进行麻醉，待麻醉满意后，将实验鼠固定于手术台，酒精消毒后，沿腹中线切开暴露腹腔并分离腹主动脉，行无菌腹主动脉采血5 ml左右。并取L4/5、L5/6椎间盘组织，液氮冻存，然后置于-80℃冷冻冰箱中，用于后续检测。

1.3.2 ELISA 检测

根据ELISA 酶联试剂盒步骤，准确布板，做3个重复孔，使用全自动酶标仪测定450 nm 波长，绘制标准曲线，计算大鼠血清IL-10、MIF、TNF-α 样品浓度。IL-10、MIF、TNF-α ELISA 试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司，全自动酶标仪（型号：ELx800）购自美国BioTek 公司。

1.3.3 组织样本处理与western blot 检测

对组织样品进行蛋白提取，蛋白样品用10%SDS-PAGE 凝胶电泳分离，然后电转移到PVDF 膜上，浸泡于缓冲液中，摇床中轻摇1 h，分别加入一抗（Notch1 抗体、II 型胶原抗体、GAPDH 抗体），将其置于4℃下的环境下过夜，使用TBST 缓冲液重复冲洗3 次后，加入山羊兔二抗（Goat Anti-Rabbit IgG+HRP），放于避光的室内孵育50 min，使用ECL显色液对PVDF 膜进行浸泡1 min，在暗室中进行曝光处理，再通过光敏感材料进行显影并定影，使用Quantity One v.4.6.2 软件对条带灰度值进行读取并记录。目的蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值。Notch1 抗体、II 型胶原抗体、GAPDH抗体、Goat Anti-Rabbit IgG+HRP 均购自上海江莱生物科技有限公司。二氧化碳培养箱（型号：3111）购自美国Thermo 公司。双垂直电泳槽（型号：MP-8001）、转移槽（型号：MP-3030）、电泳仪（型号：PP-1150）均购自北京凯元信瑞仪器有限公司。脱色摇床（型号：TS-2000A）购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.4 统计学方法

使用SPSS 26.0 对数据进行统计学分析，计量数据以±s表示。由于各资料满足正态分布而不满足方差齐性，故采用单因素Welch's方差检验，两两比较采用LSD法，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清ELISA 检测结果

与正常对照组对比，退变组与药物组的大鼠血清IL-10、MIF、TNF-α 浓度显著增加；与退变组比较，药物组的大鼠血清IL-10 浓度显著增加（P＜0.05），而药物组的MIF、TNF-α 浓度显著降低（P＜0.05）。综上，大鼠血清IL-10 浓度水平为药物组＞退变组＞正常对照组；大鼠血清MIF、NF-α 浓度水平退变组＞药物组＞正常对照组。与正常对照组对比，退变组与药物组的大鼠Notch 1 相对表达量显著增加（P＜0.05），而II 型胶原相对表达量显著降低（P＜0.05）。

表1 三组动物检测结果比较Table 1 Comparison of test results among the three groups of animals

2.2 椎间盘组Western blot 检测结果

与正常对照组比较，退变组与药物组的Notch1蛋白表达水平均明显升高，II 型胶原蛋白表达水平均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与退变组比较，药物组Notch1 蛋白表达水平明显降低，II型胶原蛋白表达水平明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。综上，大鼠椎间盘Notch1 蛋白表达水平为：退变组＞药物组＞正常对照组；大鼠椎间盘II型胶原蛋白蛋白表达水平为：正常对照组＞药物组＞退变组。

3 讨 论

IDD 常表现为腰部疼痛及功能障碍，在中医学理论中，多归属于“痹证”、“腰痛”等范畴，对于其病因的认识，多归于“风、寒、湿三气杂至”，而风、寒、湿三邪气皆至常为素体亏虚之故。脊柱为督脉所在，主一身之阳气，明代著名的医家张景岳认为：“阳动而散，故化气，阴静而凝，故成形”。阳气主动，是维持人体各项机能的主要动力，阳气可散，能够率领血液和水谷精微布散周身。因此，当阳气不足、阴邪偏盛时，精气不能弥散全身，水湿痰瘀而停留积聚于机体某处，在IDD 可表现为在脊柱积聚，甚至因“阴成形”导致突出物形成、黄韧带肥厚、关节突增生等［12］。因此，IDD 的产生、预后、转归皆以阴阳失衡为本、血气瘀滞为标，尤其在患病早期肾阳不足，阳化气功能的衰退所占比例较大，右归丸作为温阳法代表性经方，以温肾阳为本增“阳化气”之力，以活血化瘀行气为用散有形结之邪。

Notch 通路与IDD 密切相关，其相关关键蛋白及基因参与了椎间盘的修复与保护［13，14］。Notch 信号通路是高度保守的信号转导途径，多在相邻细胞间相互作用时起效，主要在骨骼的发育过程中发挥作用，参与终板软骨细胞的增殖与分化，与椎间盘细胞的修复相关［15～17］。Notch 受体和靶基因可以在人类退化的椎间盘中表达，Notch 信号蛋白的含量也会相应增加［18］。且Notch 受体的表达水平与年龄相关，在中年段退化椎间盘的髓核组织更高，低年段非退行性的椎间盘样本中较少。此外，椎间盘内含氧量较低，没有血液供应，营养主要来源于终板内毛细血管网。在椎间盘早期的退变过程中，软骨终板的血液供应开始减少，但新生血管网的增加有助于提供充足的营养，促进损伤修复。Notch 通路可以与血管内皮生长因子共同调节血管的新生过程，参与椎间盘退变［19］。Western blot 结果显示，Notch1 蛋白在退变组和药物组中的水平显著增加，又以退变组的增加更为明显，这可能代表着试图修复退化椎间盘的常驻细胞的补偿反应发生，因此，后期仍需关注和完善不同天数Notch1 蛋白含量的对比，以期进一步阐述Notch1 蛋白与椎间盘退变的动态关系。

图1 Western blot 检测结果。1a: 电泳图；1b: 检测结果直方图。Figure 1.Western blot test results.1a Electrophoretic map;1b:Histogram of detection results.

细胞外基质是椎间盘的主要成分，包括胶原蛋白、蛋白聚糖、纤维蛋白、弹性蛋白、透明质酸、硫酸软骨素等。正常细胞外基质的合成与降解是动态平衡的，在椎间盘受损后［20］，会表现出一系列疾病特征，其中之一是髓核细胞在分子水平引发一系列级联事件［21］，进而出现促炎细胞因子的表达上调［22］，降解酶不断增加，细胞外基质成分在类型、结构、数量和比例等方面发生异常等连锁反应［23，24］。该过程在病理生理学中被认为由许多细胞因子介导的［25］。结合Western blot 实验结果，可以认为，II 型胶原蛋白表达减少是椎间盘损伤退变的特征之一，右归丸能够增加退变椎间盘内II 型胶原蛋白表达，从而发挥对退变间盘的保护作用。

炎性细胞因子的作用会引发Notch 通路的表达增加，从而促进髓核内源细胞的恢复，对已经凋亡的髓核细胞起到补偿作用。然而，当炎性因子的含量不断上升时，会导致级联反应发生，使得症状加剧，致使神经元损伤甚至死亡［26］。

IL-10 在固有免疫和适应性免疫中均可发挥免疫调节作用。在固有免疫中，它通过诱导免疫抑制反应，维持免疫稳态，抑制促炎反应。在适应性免疫中，可通过抑制CD4+T 细胞亚群的促炎效应，促进TR1 细胞的稳定性等多种方式发挥抗炎作用。IL-10通过抑制促炎因子和趋化因子的产生，调节巨噬细胞活性，可表现出对椎间盘及神经保护的直接作用［27］，与椎间盘退变的疾病发病进展密切相关。本实验结果显示，退变组的血清IL-10 浓度高于正常对照组，而右归丸能够明显放大这一过程，进一步抑制促炎效应，延缓IDD 的进展。

MIF 是一种多功能促炎因子，可拮抗糖皮质激素的免疫抑制作用，能够调节细胞周期，与线粒体自噬、细胞衰老等方面联系密切［28，29］。无论是人体组织还是动物模型，MIF 的表达水平在退化椎间盘都高于正常组织，MIF 的高表达导致椎间盘基质和微环境的改变，加剧炎症反应，不利于髓核组织的修复和再生。本课题通过动物实验证明退变组大鼠血清MIF的浓度高于正常对照组，药物组大鼠血清MIF 的浓度虽仍高于正常对照组，但明显低于退变组。因此，右归丸可通过抑制MIF 减轻炎性细胞因子对椎间盘的破坏作用。

TNF-α 主要由单核巨噬细胞合成，当TNF-α 含量异常增多时，可抑制髓核间充质干细胞活性［30］、加快ECM 降解、促进炎症反应［31］。根据本团队前期临床观察，右归丸可有效缓解腰椎间盘突出症、腰椎间盘退行性变所引发的疼痛及相关临床症状，而TNF-α 早已被证明与IDD 疼痛直接相关，ELISA 检测结果显示，退变组大鼠血清TNF-α 明显高于正常对照组，药物组大鼠血清TNF-α 含量则较退变组减少，证明右归丸可通过对间盘炎症反应状态的调节，修复退变的椎间盘组织，减轻IDD 的疼痛症状。

本实验ELISA 结果显示，右归丸能够降低IDD大鼠血清中MIF、TNF-α 的含量，增加IL-10 含量，表明右归丸可显著减少炎症细胞的浸润；Western blot 结果显示，右归丸能上调椎间盘中II 型胶原蛋白表达，降低Notch1 蛋白表达。表明右归丸可缓解细胞外基质降解，有助于维持髓核的正常代谢，参与调控Notch 通路。综上所述，右归丸能够减轻IDD 大鼠炎症反应，维持细胞外基质代谢平衡，延缓IDD，其机制可能与Notch 通路有关。