灰霉病致病机理及其防治措施研究进展

王方方，付清泉，史学伟，王 斌

（石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000）

灰霉病是由灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）引起的一种常见真菌病害，发生在植物的茎、叶、花、果实和种子等部位[1]，可以引起1 000 多种果蔬发病，受到侵染的果蔬表面会出现白色或灰色的霉斑，受感染的部位会出现软腐烂和褐变，在全球范围内造成巨大的经济损失（超过100 亿美元）[2]。B.cinerea 更容易侵染受损或衰老组织，导致植物损伤严重甚至死亡，并且具有传播速度快、寄主范围广和病原菌遗传变异性高等特点，被称为世界第二严重植物病原体[3]。研究表明，B.cinerea 通过侵入寄主的表皮进行繁殖，产生一些细胞降解酶（CWDEs）[4]、毒素[5]、有机酸[6]等物质来调控灰霉病的发病，或者通过基因来调控灰霉病的发病[7]。针对B.cinerea 引发的果蔬腐败有多种防治方法，包括化学防治[8]、农业防治[9]和生物防治[10]，这些方法均是通过降低菌体感染率来控制灰霉病的爆发。

本文总结了植物生长过程中不同部位（叶片、花序和果穗）感染灰霉病的主要症状，影响植物灰霉病发病的重要因素，B.cinerea 致植物灰霉病的分子机理，以及植物灰霉病防治技术，旨在为果蔬灰霉病防治相关研究提供理论参考。

1 灰霉病的症状及发病特征

1.1 症状

B.cinerea 对植物的危害分布在植物生长的整个时期，从叶片部位一直到花序、果穗都可能受到危害。首先会侵染叶片，主要表现为叶片多从叶尖或叶边缘开始发病，叶片边缘有棕色“U”或“V”形损伤，出现淡褐色且不规则病斑，发病严重时病斑呈现不规则轮纹，环境较潮湿时，病叶组织的下侧可以观察到大量的灰色孢子[11]。对花序、果穗的危害主要分为两个时期：第一个时期是在开花前及幼果时期，花序被病菌感染初期呈淡褐色水渍状，后期发病部位逐渐转为暗褐色，病部组织软腐，进一步发展至萎蔫甚至坏死[12]。第二个时期是在果实着色至成熟期阶段，果穗上的果实呈火柴头大小时就会染病，产生淡褐色、水浸状病斑，后病斑变为褐色[13]。浆果在早期受到侵染时会出现圆形的凹陷病斑，虽然果实的硬度没有受到影响，但果皮上出现的病斑颜色和正常组织的颜色相比较浅[14]。

1.2 发病特征

B.cinerea 是一种坏死性兼性腐生病菌，对外界环境的要求不高，其不仅会在田间发病，还会在贮藏、运输过程中造成感染，进而引起果蔬腐烂，质量下降等不良效果[15]。B.cinerea 拥有广泛的寄主范围和多种攻击模式[16]，并对多种水果、谷类、叶菜、豆类产生病害，尤其会影响葡萄、草莓、番茄等农作物产量，造成严重经济损失[17]。B.cinerea 主要以菌丝体或菌核随病残体在土壤中越夏或越冬，病原菌萌发产生的分生孢子和菌丝，会伴随空气、雨水和人类的生产活动等方式进行传播[18]。外界环境主要是冠层内的小气候条件会影响灰霉病的发病，其中的温度和湿度（相对湿度和自由湿度）更是B.cinerea 感染的关键因素[19]。当相对湿度低于81%时，分生孢子不能萌发，在90%～98%时开始大量萌发，分生孢子在0～30 ℃之间萌发，最适温度为20～25 ℃[20]。B.cinerea 是一种适应偏低温度和较高湿度的病原菌，当外界环境持续低温、高湿或光照不足时，植物更容易受到感染，导致严重发病[21]。除了温度和湿度影响灰霉病的发病外，各地区品种的不同[22]、大气CO2浓度[23]、定植密度过大[24]、施肥不科学[25]、生长调节剂超量使用[26]等因素都对灰霉病的发病有诱导作用。

2 B.cinerea 的致病机理

B.cinerea 对宿主的致病过程包括侵入宿主表皮，杀死植物细胞和引起组织腐烂三个阶段[27]。在致病过程由多种毒素、酶、代谢物、基因等因素共同调控[5]。

2.1 侵入表皮

分生孢子高度丰富且普遍存在，主要通过伤口或自然开口进入宿主细胞[28]。植物细胞壁是保护植物细胞应对外来风险的一道屏障，主要是由中胶层、初生壁以及次生壁构成，其成分主要是多糖和蛋白质，如果胶、纤维素和半纤维素等物质[29-30]。作为一种坏死性真菌，B.cinerea 附着胞体的强度不足以破坏植物细胞壁，且由B.cinerea 造成的植物表皮损伤以及机械损伤现象很少见，但B.cinerea 能分泌一系列细胞壁降解酶（CWDEs），降解宿主细胞壁，从而侵入宿主表皮[31]，例如分泌果胶酶和纤维素酶[29]、多酚氧化酶[32]、蛋白酶和磷酸酯酶[33]、木聚糖酶[34]、淀粉酶[35]等物质。其中果胶酶和纤维素酶是重要的两个酶，果胶酶靶向作用于细胞壁中的大多数多糖，导致细胞壁裂解[29]。果胶酶和纤维素酶在协同作用下能促使细胞结构的破坏与解离，细胞壁被降解后会引起组织软化，进而使得表皮的保护屏障受损，由此增加了擦伤的可能性，并为真菌提供了单糖作为碳源的途径，有利于B.cinerea 的侵入、定殖和扩展[3]。此外，B.cinerea 还具有六种不同降解细胞壁的聚半乳糖醛酸酶（PGs）基因，它们是可以介导宿主相互作用和潜在宿主强化基因的强活性代谢物，其中多聚半乳糖醛酶是主要的降解酶，也是致病因子之一[36]。

2.2 杀死植物细胞

B.cinerea 裂解宿主细胞壁以达到破坏其表皮保护屏障的效果，在细胞壁裂解后会进一步侵入寄主细胞组织，破坏植物细胞，从而加速灰霉病的发生[37]。

2.2.1 毒素的致病作用

在B.cinerea 侵入植物表皮的过程中，会分泌一些植物毒性代谢物，主要为高倍半萜烯葡萄孢素（Sesquiterpen botrydial）和高取代内酯（Botcinolide）[31]。其中高倍半萜烯葡萄孢素是非特异性毒素且毒性最高，可以作用于多种农作物和基因，其侵染植物的能力很强，更容易引发感染[17]。除了这两种毒素之外，草酸也是重要的植物毒性代谢物[29]。灰葡萄孢霉分泌草酸可以降低植物细胞内pH 值并刺激果胶酶、蛋白酶等真菌酶的产生和活性。此外，草酸积累导致Ca2+螯合，进而削弱植物细胞壁的果胶结构[3]。这些毒素在B.cinerea 侵染中发挥着重要的作用，能够破坏细胞膜的通透性，造成细胞的质壁分离和细胞器的损伤，加速B.cinerea 的侵染，同时也会使宿主产生褐色病斑、白化或者枯萎等症状，对宿主造成不同程度的危害[38]。

活性氧（ROS） 是公认植物免疫系统的重要组成部分，包括超氧阴离子（O2-·）、羟基自由基（-OH）和某些非自由基氧化剂如氢过氧化物（H2O2）和臭氧（O3），可以转化为自由基[4]。在水果受到B.cinerea 侵染或生物、非生物因素胁迫时，植物与病原体相互作用会短时间产生大量的活性氧[39]。ROS 对入侵病原体具有直接的细胞毒性，可能通过促进角质层聚合物的氧化来渗透宿主细胞，ROS的过度产生会诱导植物的防御反应，由此造成大量H2O2的积累，最终可诱导超敏反应（HR） 的程序性死亡（PCD），宿主中高浓度的ROS 和随后的细胞死亡阻碍了生物营养病原体的传播[5]。

2.2.2 基因的调控

亲环蛋白（Cyp）是与真菌形态发生和产生毒力相关的成分[36]。农杆菌转化法（Agrobacterium tumefaciensmediated transformation，ATMT）已被证明是鉴定致病性相关基因的方法，通过ATMT 法表明了BcCYP2 是灰霉病菌产生毒力的相关基因，BcCYP2 的破坏不会损害病原体的菌丝生长、渗透、氧化和细胞壁的完整性，但会延迟分生孢子的萌发，改变分生孢子的形态，以及减少感染垫（IC）的形成，产生毒力降低的效果[40]。低聚半乳糖醛酸酶（Oligogalacturonase）被认为是植物防御反应的激发因子，它的分泌减少会降低植物的防御反应[41]。通过克隆编码BcPg1 基因进行试验，表明BcPg1 不会显著影响初始感染的频率，但可以观察到参与试验的果实和叶片的损伤生长速率有了显著的降低，表明BcPg1 与灰霉病的毒力有关[42]。此外富含半胱氨酸的受体样激酶（CRKs）也是普遍存在的植物受体样激酶，它在植物抗病中起着重要作用，在灰霉病栽培品种中VaCRK2 接种和茉莉酮酸甲酯处理后，抗灰霉病的葡萄品种中VaCRK2 的表达明显增强，引起致病机制相关基因（PR）的上调和活性氧（ROS）的积累，VaCRK2 能促使植物激活PR 基因的表达和氧化，从而对灰霉病病菌产生抗性[43]。除此之外还有BcVea[27]、Rho3[44]、Slt2-MAPK[45]、BOSI[46]等基因都是灰霉病病菌生长发育或致病的相关基因，都发挥着不同的作用。而且孢子的生长速率也和基因有着重要联系，研究表明BcCYP2 介导B.cinerea 菌核的产生和形态发生，但对于孢子的萌发是必不可少的，bmp1 缺失突变体产生正常的分生孢子和菌丝体，但生长速度降低，说明孢子的生长速率和bmp1 有着不可分割的关系[47]。

3 防治措施

目前对灰霉病的防治策略为“预防为主，综合防治”，主要通过化学防治、农业防治和生物防治技术对灰霉病进行防治。

3.1 化学防治

化学防治主要通过喷洒农药进行，是目前国内使用最多的防治方法[9]。目前用于化学控制灰霉病的试剂主要包括苯并咪唑类、对二甲酯亚胺类、甲氧基丙烯酸酯类、环己酰胺、苯（苄）胺基嘧啶类、N-苯基氨基甲酸酯类等，具有高效、快捷、实用性强等优势，其中最主要的杀菌剂为二甲酰亚胺类和苯胺基嘧啶类杀菌剂[48]。但是长期使用化学杀菌剂会引起植物的抗药性，往往通过加大药剂的使用量达到效果，而过度使用化学药剂会造成药剂的残留，对人们健康存在潜在威胁，也会对环境、土壤造成污染，从而导致多方面的不利影响[49]。

通过对比不同杀菌剂对湖北省各地产区番茄和草莓采集的B.cinerea 的研究可知，腐霉利抗性菌株对二甲酰亚胺类杀菌剂存在正交互抗性，但对苯吡咯类杀菌剂没有交互抗性[50]。而不同地区的草莓对于杀菌剂的抗药性也不相同，通过对河北、北京、四川等6 个不同地区的草莓进行样本采集，考察不同的杀菌剂对B.cinerea 的抗药性频率，研究表明在灰霉病菌样本群体为251 时，乙霉威、腐霉利、多菌灵抗药性频率分别为67.33%、45.02%和64.94%，同时发现对以上杀菌剂都具有敏感性的菌株仅有3 株且频率为1.2%，而且对3 种杀菌剂全部表现抗药性的菌株为17.53%，以上研究表明样本草莓B.cinerea出现了较为严重的多重抗药性现象[51]。

为解决植物对化学杀菌剂产生抗性这一现象，主要措施是将几种化学杀菌剂进行复合调配来延缓灰霉病的发病，但需要对杀菌剂的使用量进行进一步的调控，且针对不同产区的植物对不同化学杀菌剂的抗药性问题需要分析考察当地地域特征，进一步确定合适的药剂来对灰霉病进行有效的控制[52]。

3.2 农业防治

农业防治主要通过选育优良的抗病品种，在植物生长期阶段清理病残体[9]、控制温度和湿度[3]、簇紧密度和稀疏、合理的人工轮作[53]、增加穿过和围绕植物的光照和气流[2]、衰老组织的物理去除等方式来降低灰霉病的感染率。

豇豆灰霉病主要通过农业防治来控制灰霉病的发病，将豇豆与葱蒜、禾木类植物进行2～3 年的轮作或者将播种期提前因此来避开高温和多雨时期，及时对种植地区的温度、湿度、空气等环境条件进行调控和处理，防止灰霉病发生或控制灰霉病的发病[54]。河南一地区通过农业防治、生态防治建立了绿色防控草莓示范基地，主要对草莓优质抗病的品种进行选育或对草莓进行脱毒种苗、合理进行肥料配比和施肥、及时摘除老叶和病叶，对有效抑制灰霉病的发病提供了一条绿色、高效、安全、环境友好的技术模式。在大棚草莓的灰霉病防治中仅仅只靠化学防治往往是不够的，需要结合物理和生态的防治，特别是将已经发生病害的叶片或组织及时摘除，防止病原菌的进一步扩散造成更加严重的病害，再加上对大棚内湿度的控制、白天和晚上温度的调整，实现了对大棚内草莓灰霉病的有效控制[55]。

虽然通过农业防治来控制灰霉病的发生能延缓灰霉病的发生，但农业预防局限性仍较大，尤其需要对外界温度和湿度的要求十分严格，且需要及时地识别病害并且摘除病害，一旦控制不好会导致发病加剧[56]。

3.3 生物防治

生物防治对于灰霉病的控制具有较好的前景和潜力，因为微生物对环境的适应性较强，且菌种的来源广泛、安全，表现出低污染、无毒残留等优势[57]。目前用于生物防治灰霉病的菌种主要为细菌和酵母菌等，通过不同的菌种来控制不同植物的灰霉病是有效的。拮抗生物的主要作用机制是通过寄生植物的寄生、营养的竞争、诱导系统获得性抗性（SAR）、诱导系统性抗性（ISR）等多种防御机制的产生来防治灰霉病[58]。

用于生物防治的细菌主要有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）等。枯草芽孢杆菌NSW-3-1 是从党参中筛选出来的一株具有较强抑制作用的细菌，当发酵液菌种浓度为1×108CFU/mL 时防治的效果最好，并且该菌株不仅有很好的抑制作用，而且可以促进党参的生长，是一株良好的生物防治细菌[59]。枯草芽孢杆菌L1-21 可以在植物内部组织定殖，具有良好的环境适应性，通过和B.cinerea 共同培养，枯草芽孢杆菌L1-21 表现出强烈的拮抗作用，且浓度越高疾病的发生率越低，从而达到了较好的控制效果[60]。从银杏组织分离的内生细菌菌株中筛选出来了一株B.cinerea 抑菌活性较好的解淀粉芽孢杆菌HZ-6-3的抑制作用最强，抑制率为79.06%，能够显著抑制病原菌的菌丝生长。此外木霉DQ-1、贝莱斯芽孢杆菌ZSY-1、印楝内生放线菌R6 等植物中筛选出来的细菌都可以有效的控制灰霉病的发生且促进植物的生长，是优质的细菌生物防治菌[61]。

酵母作为采后灰霉病的生物防治菌株具有很好的抗菌效果。从水果中筛选出来了一株美极梅奇酵母（Metschnikowia zizyphicola）T-2，它可以通过产生挥发性有机物（VOCs）来减少蓝莓在贮藏期引起的果实腐烂，通过对蓝莓在储藏期品质的感官指标、理化指标、风味指标等指标的测定发现美极梅奇酵母T-2 不会损害蓝莓的品质，且该菌株会诱导蓝莓体内的黄酮和酚类物质的积累来提高蓝莓的抗性，通过将蓝莓经过美极梅奇酵母T-2 的处理后平板培养发现其可直接抑制B.cinerea 的菌丝生长和孢子萌发[62]。白色念珠菌（Candida pseudolambica） 是一种常见于各种环境中的酵母，用从海洋中分离出来的一株白色念珠菌W-16 处理侵染B.cinerea 桃子的第3 天，发现灰霉病的发病率降低了41.2%，说明白色念珠菌W16 对桃子灰霉病的防治有较好的效果，且白色念珠菌W-16 产生的VOCs 抑制了B.cinerea 的菌丝生长和分生孢子的萌发，并引起了菌丝体形态和超微结构的异常，但其不会对桃子的品质产生影响[63]。美极梅奇酵母T-2、白色念珠菌W16 可以通过VOCs 与果实相互作用来提高其抗性和直接抑制B.cinerea 的生长，从两个方面降低了宿主的发病率，除此之外还有解淀粉芽孢杆菌BP30、酵母菌KD-16J、间型假丝酵母C410 等多种酵母菌都可以较好的抑制灰霉病的发病[64]。

4 小结

灰霉病作为一种危害植物的真菌病害，严重时可以造成80%的减产，受到了人们广泛的关注[65]。灰霉病的致病机制是多方面的，致病菌B.cinerea 通过侵入寄主表皮在植物组织中迅速生长，通过产生酶类、毒素、有机酸、基因等多方面影响植物生长。目前对灰霉病的控制主要通过化学、农业及生物防治方法，但化学试剂的过量使用会造成环境的污染和农药残留，严重危害了环境及人类健康，农业防治工程量较大且不易控制，相较而言生物防治的安全、无毒无害等优势较明显，应该积极发展生物方面对灰霉病的防治，加快环境友好型微生物菌剂的研制、升级和示范推广。总之利用可替代策略来控制病害的发生已经成为了迫切的需求，安全、绿色、高效、可行的使用无公害绿色的防治手段日益受到了重视，成为今后科研的研究重点。