超分子水杨酸对兔耳痤疮模型p38MAPK/NF-κB信号通路的影响

杨力 刘尚可 林新瑜 罗霞 肖媛媛

[摘要]目的：探究超分子水楊酸对兔耳痤疮模型p38MAPK/NF-κB信号通路的影响机制。方法：将30只实验兔随机分成正常对照组、2%超分子水杨酸（Salicylic acid，SA）组、30%SA组、夫西地酸组、模型对照组，每组6只，并予以相应外用药物干预，连续4周，并分别于用药2周后、用药4周后检测p38MAPK、NF-κB、IL-1β、IL-8蛋白的表达。结果：结果显示，随着用药时间的延长，各组的p38MAPK、NF-κB、IL-1β、IL-8均呈下降趋势。用药前，各组间p38MAPK、NF-κB、IL-1β、IL-8蛋白表达均差异无统计学意义（P＞0.05）。用药2周后，2%SA组、30%SA组、夫西地酸组p38MAPK、NF-κB、IL-1β、IL-8低于模型对照组（P＜0.001）；三个用药组之间p38MAPK、NF-κB、IL-1β两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）；2%SA组IL-8低于30%SA组、夫西地酸组（均P＜0.05）；30%SA组与夫西地酸组IL-8差异无统计学意义（P＞0.05）。用药4周后，三个用药组p38MAPK、NF-κB、IL-1β、IL-8低于模型对照组（P＜0.05）；2%SA组、30%SA组p38MAPK、NF-κB、IL-8低于夫西地酸组（P＜0.05），2%SA组IL-8低于30%SA组（P＜0.05）；2%SA组与30%SA组p38MAPK差异无统计学意义（P＞0.05）；2%SA组、30%SA组与夫西地酸组IL-1β均差异无统计学意义（均P＞0.05）；2%SA组IL-1β低于30%SA组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：超分子水杨酸可通过抑制p38MAPK/NF-κB信号通路来发挥抗炎作用，且随着用药时间的延长疗效也在逐渐增加，并优于夫西地酸。

[关键词]痤疮；兔耳痤疮模型；超分子水杨酸；抗炎；p38MAPK/NF-κB信号通路

[中图分类号]R758.73+3    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2024）03-0001-05

Effect of Supramolecular Salicylic Acid on p38MAPK/NF-κB Signaling Pathway in Rabbit Ear Acne Models

YANG Li1，LIU Shangke2，LIN Xinyu3，LUO Xia1，XIAO Yuanyuan1

（1.Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou 646000，Sichuan，China; 2.Medical School，University of Electronic Science and Technology of China，Chengdu 611731，Sichuan，China; 3.Institute of Dermatology and Venereology，Sichuan Academy of Medical Sciences，Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610072，Sichuan，China）

Abstract： Objective  To explore the effect of supramolecular salicylic acid on p38MAPK/NF-κB signaling pathway in rabbit ear acne model. Methods  Divided thirty experimental rabbits into normal control group， 2%SA group， 30%SA group， fusidic acid group and model control group（There were 6 rabbits in each group） randomly. Gave corresponding external drug intervention for 4 weeks. Detected the expressions of p38MAPK， NF-κB， IL-1β and IL-8 after 2 weeks and 4 weeks. Results  Result display， P38MAPK， NF-κB， IL-1β， and IL-8 of each group showed a downward trend after treatment. Before treatment， there were no significant differences in expression of p38MAPK， NF-κB， IL-1β and IL-8 among groups （P＞0.05）. After 2 weeks of treatment， p38MAPK， NF-κB， IL-1β， and IL-8 of 2% SA group， 30% SA group and fusidic acid group were lower than model control group （P＜0.001）. There were no significant differences in p38MAPK， NF-κB， and IL-1β （P＞0.05）. IL-8 of 2% SA group was lower than 30% SA group and fusidic acid group （all P＜0.05）. There was no significant difference in IL-8 between 30% SA group and fusidic acid group （P＞0.05）. After 4 weeks of treatment， p38MAPK， NF-κB， IL-1β， and IL-8 of three treatment groups were lower than model control group （P＜0.05）. p38MAPK， NF-κB， IL-8 of 2% SA group and 30% SA group was lower than fusidic acid group （P＜0.05）， IL-8 of 2%SA group was lower than 30%SA group （P＜0.05）. There was no significant difference in p38MAPK between 2%SA group and 30%SA group （P＞0.05）. 2% SA group， 30% SA group and fusidic acid group had no significant difference in IL-1β （all P＞0.05）. 2%SA group IL-1β was lower than 30%SA group， the difference was Statistical significance （P＜0.05）. Conclusion  Supramolecular salicylic acid can exert an anti-inflammatory effect by inhibiting the p38MAPK/NF-κB signaling pathway， and the curative effect gradually increases with the prolongation of medication time， and is superior to fusidic acid.

Key words： acne; rabbit ear acne models; supramolecular salicylic acid; anti-inflammatory; p38MAPK/NF-κB signaling pathway

寻常痤疮是发病率极高的慢性炎症性皮肤病，为全球八大流行病之一，共计约9.4%的人口受累[1]。目前其公认的发病机制中包括毛囊漏斗部角化过度、P.acnes繁殖、皮脂分泌过度、炎症反应及宿主的免疫反应、性激素变化及精神心理等因素[2]。其中P.acnes引起的炎症反应在痤疮发病机制中至关重要。组织病理、免疫以及临床研究等多方面均已经证实炎症反应参与了痤疮整个发病周期，组织病理甚至证实痤疮患者正常皮肤也已经存在炎症反应[3-4]，但由于该病理过程涉及了一系列由细菌及生化反应引起的细胞增殖异常和免疫微环境功能紊乱，故其具体的分子机制目前仍不清楚。有部分学者提出p38MAPK/NF-κB信号通路与P.acnes诱导的炎症因子产生相关[5]。本研究旨在探讨超分子水杨酸对兔耳痤疮模型的疗效及其抗炎机制，拟初步探究超分子水杨酸对p38MAPK/NF-κB信号通路的影响。

1  材料和方法

1.1 实验动物：12周龄健康雄性新西兰兔30只，体重2.0～2.2 kg，由西南医科大学实验动物中心提供，质量合格证号：No.0044147。生产许可证号：SCXK（川）2018-17。

1.2 主要实验试剂：痤疮丙酸杆菌标准菌株（广东省微生物研究所菌种保藏中心）、VITEK MS-CHCA基质液（法国生物梅里埃公司）、组织标本固定液（国药集团化学试剂有限公司）、兔p38MAPK、NF-κB、IL-1β、IL-8抗体（北京博奥森生物技术有限公司）、山羊抗兔工作液、山羊血清封闭液、浓缩型DAB试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司）、夫西地酸乳膏（香港澳美制药厂有限公司，国药准字H20243096）、2%超分子水杨酸调理凝露（四川亚姿宣生物科技有限公司，沪G妆网备字2017012089）、30%超分子水杨酸焕颜面膜（四川亚姿宣生物科技有限公司，沪松械备20170017号）。

1.3 主要实验仪器：MALDI-TOF MS 质谱仪（法国生物梅里埃公司）、TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机（常州市中威电子仪器有限公司）、BMJ-Ⅲ型包埋机（常州郊区中威电子仪器厂）、PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪（常州市中威电子仪器有限公司）、BA400Digital数码三目摄像显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）、图像分析软件Image-Pro Plus 6.0（美国Media Cybernetics公司）。

1.4 实验方法：将30只实验兔随机分成正常对照组、2%SA组、30%SA组、夫西地酸组、模型对照组，每组6只。正常对照组不做任何处理，其余四组参照Kligman法[6]构建兔耳痤疮模型，用玻璃棒蘸取煤焦油并均匀涂在双耳内侧面耳管开口处，范围约2 cm×2 cm，每次约0.5 ml，每日1次，连续14 d。造模第7天时，皮下多点注射P.acnes菌悬液约50微升/耳（浓度：0.5麦氏比濁单位）。造模结束后，对造模组兔耳造模处行组织病理检查，镜下确认造模成功后开始外用药物干预。动物实验经过笔者医院伦理委员会审批。

1.4.1 干预方法：各组干预方法具体如下。2%SA组：外用2%超分子水杨酸调理凝露，每日1次，连续4周；30%SA组：外用30%超分子水杨酸焕颜面膜，每周1次，每次待药物发挥作用15 min左右即用清水将其洗净，连续4次；夫西地酸组：外用夫西地酸乳膏，每日1次，连续4周；模型对照组：外用生理盐水，每日1次，连续4周。

1.4.2 取材方法：分别在造模结束后、用药2周后、用药4周后进行实验兔处死取材。先剃除兔耳耳背的兔毛，再从耳缘静脉快速注射10 ml空气处死后用直径5 mm打孔器钻取全层皮肤，无菌纱布拭干血液，经4%多聚甲醛溶液固定。

1.4.3 组织病理学观察：将病理切片经脱水、透明、浸蜡与包埋、切片脱蜡、HE染色后于电子显微镜下观察。

1.4.4 p38MAPK、NF-κB、IL-1β、IL-8免疫组化检测：固定组织经脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡后，进行免疫组化染色并采用BA200 Digital数码三目摄像显微摄像系统观察并采集切片图像，每张切片先于100倍下观察全部组织，再选取3个视野分别采集400倍显微图像。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定全部切片图像的积分光密度（Integrated optical density，IOD）和面积，并计算每张图的平均光密度（Mean optical density，MOD），再用3张图的MOD计算均值，即为每例样本的MOD。

1.5 统计学分析：采用SPSS 21.0对数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x?±s）表示，两独立样本的均数比较进行t检验；单因素多水平重复测量设计的多组均数比较进行重复测量方差分析，P＜0.05有统计学意义。

2  结果

2.1 兔耳痤疮造模结果：通过肉眼观察、组织病理学观察来判定造模成功与否，并进行免疫组化检测p38MAPK、NF-κB、IL-1β、IL-8蛋白的表达，与正常对照组进行对比。

2.1.1 肉眼观察结果：正常对照组兔耳软而薄，透光可，毛细血管网清晰，耳管开口处毛囊口排列规则，分布均匀、细密、平整（见图1A）。造模组兔耳水肿明显，局部变硬、粗糙增厚，透光度降低，毛细血管网难以辨别，毛囊口扩张，可见明显堵塞的黑色角栓，兼有散在红色炎性丘疹和脓疱（见图1B）。

2.1.2 组织病理学观察结果：正常对照组兔耳组织表皮结构清晰，角质层较薄；真皮胶原纤维交错排列，胞质红染，间质可见少量毛囊及皮脂腺等附属器结构，毛囊体积正常、内容物少，毛囊壁未见增生，皮脂腺体积正常，附属器周围无炎细胞浸润；真皮肌层肌纤维平行排列，未见明显增生（见图2A）。造模组兔耳组织表皮结构不清，局部增厚，可见角化过度，棘层肥厚；真皮内成纤维细胞增生，胶原纤维灶状坏死，胞质崩解，轮廓模糊不清，毛囊体积明显增大，其内出现大量角化物质并扩大成壶状，毛囊壁显著增厚，皮脂腺体积增大，分叶增多，附属器周围可见大量炎症细胞浸润（见图2B）。

2.1.3 免疫组化检测p38MAPK、NF-κB、IL-1β和IL-8蛋白表达结果：造模组p38MAPK、NF-κB、IL-1β和IL-8蛋白呈强表达，正常对照组呈弱表达，免疫组化MOD测定结果对比见表1。两组免疫组化染色见图3～6。

2.2 各用药组免疫组化检测p38MAPK、NF-κB、IL-1β、IL-8蛋白表达结果

2.2.1 各用药组p38MAPK蛋白表达检测结果：由于时间和分组存在交互效应，故本研究限定时间对p38MAPK蛋白表达的影响，仅考虑分组对其产生的影响，进行简单效应分析，组间比较结果如下。用药前，各组间两两比较p38MAPK蛋白表达均差异无统计学意义（P＞0.05）。用药2周后，2%SA组、30%SA组、夫西地酸组p38MAPK蛋白表达低于模型对照组（P＜0.001）；2%SA组与夫西地酸组、30%SA组与夫西地酸组、2%SA组与30%SA组p38MAPK蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。用药4周后，2%SA组、30%SA组、夫西地酸组p38MAPK蛋白表达低于模型对照组（P＜0.001）；2%SA组、30%SA组p38MAPK蛋白表达低于夫西地酸组（P＜0.001）；2%SA组与30%SA组p38MAPK蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。此外，限定分组对p38MAPK蛋白表达的影响，仅考虑时间对其产生的影响，进一步进行简单效应分析，组内比较结果如下：四个组的p38MAPK蛋白表达均随着时间的延长呈下降趋势，且每个组的各时间点间均有差异（P＜0.05）。p38MAPK蛋白表达测定结果见表2。

2.2.2 各用药组NF-κB蛋白表达检测结果：简单效应分析组间比较结果如下。用药前，各组间两两比较NF-κB蛋白表达均差异无统计学意义（P＞0.05）。用药2周后，2%SA组、30%SA组、夫西地酸组NF-κB蛋白表达低于模型对照组（P＜0.001）；2%SA组与夫西地酸组、30%SA组与夫西地酸组、2%SA组与30%SA组NF-κB蛋白表达差异无统计学意义（均P＞0.05）。用药4周后，2%SA组、30%SA组、夫西地酸组NF-κB蛋白表达低于模型对照组（P＜0.05）；2%SA组、30%SA组NF-κB蛋白表达均低于夫西地酸组（P＜0.001）；2%SA组与30%SA组差异无统计学意义（P＞0.05）。组内比较结果如下：四个组的NF-κB蛋白表达均随着时间的延长呈下降趋势，模型对照组用药前与用药2周后NF-κB蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），其余三组的各时间点间均有差异，差异具有统计学意义（P＜0.05）。NF-κB蛋白表达测定结果见表3。

2.2.3 各用药组IL-1β蛋白表达检测结果：简单效应分析组间比较结果显示，用药前，各组间两两比较IL-1β蛋白表达均差异无统计学意义（P＞0.05）。用药2周后，2%SA组、30%SA组、夫西地酸组IL-1β蛋白表达低于模型对照组（P＜0.001）；2%SA组与夫西地酸组、30%SA组与夫西地酸组、2%SA组与30%SA组IL-1β蛋白表达差异无统计学意义（均P＞0.05）。用药4周后，2%SA组、30%SA组、夫西地酸组IL-1β蛋白表达低于模型对照组（P＜0.05）；2%SA组、30%SA组与夫西地酸組IL-1β蛋白表达均差异无统计学意义（P＞0.05）；2%SA组IL-1β蛋白表达低于30%SA组（P＜0.05）。四个组的IL-1β蛋白表达均随着时间的延长呈下降趋势，且每个组的各时间点间均有差异（P＜0.05）。IL-1β蛋白表达测定结果见表4。

2.2.4 各用药组IL-8蛋白表达检测结果：简单效应分析组间比较结果显示，用药前，各组间两两比较IL-8蛋白表达均差异无统计学意义（P＞0.05）。用药2周后，2%SA组、30%SA组、夫西地酸组IL-8蛋白表达低于模型对照组（P＜0.001）；2%SA组IL-8蛋白表达低于30%SA组、夫西地酸组（均P＜0.05）；30%SA组与夫西地酸组IL-8蛋白表达差异无统计学意义（P=0.436）。用药4周后，2%SA组、30%SA组、夫西地酸组IL-8蛋白表达低于模型对照组（P＜0.05）；2%SA组、30%SA组IL-8蛋白表达低于夫西地酸组（均P＜0.05）；2%SA组IL-8蛋白表达低于30%SA组（P＜0.05）。组内比较结果如下：四个组的IL-8蛋白表达均随着时间的延长呈下降趋势，且每个组的各时间点间均有差异（P＜0.05）。IL-8蛋白表达测定结果见表5。

3  讨论

目前公认的痤疮发病机制为毛囊角化异常、P.acnes定植、皮脂分泌过多、炎症反应及内分泌等。其中炎症反应在痤疮的发生、发展中尤为重要，贯穿了痤疮发病的始终[7]。目前关于痤疮炎症通路研究较成熟的为p38MAPK/NF-κB信号通路，该通路可促使单核-巨噬细胞分泌过多的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎因子，从而介导天然免疫[8]。

超分子水杨酸具有抗炎、调节角化、控油、抗菌、抗血凝（促进微循环）以及美白（抑制酪氨酸酶）等多重作用[9-10]，不仅可抑制痤疮主要发病机制，还可改善色素沉着及瘢痕。由于其具有控缓释能力、生物利用度高、皮肤刺激性小、患者耐受度高等特点[11]，规避了传统水杨酸的不足，已被广泛用于治疗痤疮。临床研究发现，超分子水杨酸既可和异维A酸、盐酸米诺环素等口服药物联用，也可和激光、红蓝光、光动力、粉刺挤压术等物理治疗联用，还可单独使用治疗轻中度痤疮，均可获得较好的疗效及较高的患者满意度，且极少发生不良反应。

兔耳易于观察皮损，方便采样，具有造模时间短、可靠性及成功率高、重复性好的特点，是研究寻常型痤疮的经典模型[12]。1989年美国皮肤病学会制定了兔耳痤疮模型的规范方法，即Kligman法[13]，该法已被广泛用于痤疮模型的研究并被证实可以很好地模拟痤疮的毛囊皮脂腺导管角化异常。要同时研究痤疮炎症，还需要构建炎症模型。痤疮丙酸杆菌的定植和增殖在痤疮炎性皮损的发生发展起着重要作用[14]，它的细胞壁由较厚的肽聚糖组成，可被TLR2识别，激活NF-κB信号通路，启动IL-1β、TNF-a、IL-8、IL-12等细胞因子参与局部炎症反应和机体对其的免疫反应。痤疮模型发现在造模第7天时局部注射P.acnes混悬液后可形成明显的丘疹、脓疱等验证皮损表现[15]。本研究通过改良Kligman法，将外涂煤焦油和局部注射P.acnes混悬液联合应用，很好地构建了兔耳痤疮的毛囊皮脂腺导管角化异常和炎症模型，有利于下一步试验的开展。

本研究发现兔耳痤疮模型中p38MAPK、NF-κB、IL-1β和IL-8蛋白表达显著增多，进一步验证了p38MAPK/NF-κB信号通路在痤疮炎症中可能发挥了一定作用。2%SA组、30%SA组、夫西地酸组兔耳痤疮模型中的p38MAPK、NF-κB、IL-1β和IL-8蛋白降低程度均优于模型对照组，结果显示2%SA、30%SA、夫西地酸均可能通过抑制痤疮p38MAPK/NF-κB信号通路而发挥抗炎作用。总体而言治疗2周后2%SA、30%SA的抗炎作用与夫西地酸组相似，治疗4周后2%SA、30%SA的抗炎作用优于夫西地酸组。

综上，本研究证实超分子水杨酸可通过抑制p38MAPK/NF-κB信号通路来发挥抗炎作用，且随着用药时间的延长疗效也在逐渐增加，并优于夫西地酸，对于临床工作中超分子水杨酸在痤疮炎性皮损的治疗具有重要意义。

[参考文献]

[1]Heng A H S，Chew F T.Systematic review of the epidemiology of acne vulgaris[J].Sci Rep，2020，10（1）：5754.

[2]Kim J，Park T，Kim H J，et al.Inferences in microbial structural signatures of acne microbiome and mycobiome[J].J Microbiol，2021，59（4）：369-375.

[3]范宇焜，郝飞.痤疮丙酸杆菌在寻常痤疮发病中的作用及其机制[J].皮肤科学通报，2022，39（1）：10-17，2-3.

[4]Kanwar I L，Haider T，Kumari A，et al.Models for acne： A comprehensive study[J].Drug Discov Ther，2018，12（6）：329-340.

[5]Hou X X，Chen G，Hossini A M，et al.Aryl hydrocarbon receptor modulates the expression of TNF-α and IL-8 in human sebocytes via the MyD88-p65NF-κB/p38MAPK signaling pathways[J].J Innate Immun，2019，11（1）：41-51.

[6]No authors listed.American Academy of Dermatology invitational symposium on comedogenicity[J].J Am Acad Dermatol，1989，20（2 Pt 1）：272-277.

[7]马英，项蕾红.痤疮发病机制及治疗目标的新认识[J].临床皮肤科杂志，2015，44（1）：66-69.

[8]Lu J，Cong T，Wen X，et al.Salicylic acid treats acne vulgaris by suppressing AMPK/SREBP1 pathway in sebocytes[J].Exp Dermatol，2019，28（7）：786-794.

[9]姚露，彭红霞，周文瑞，等.超分子水杨酸联合粉刺挤压治疗寻常型痤疮疗效观察[J].皮肤病与性病，2020，42（3）：71-73.

[10]李玉江，焦丹红，曹建军，等.调Q开关1 064 nm Nd：YAG激光联合超分子水杨酸治疗黄褐斑预后分析[J].临床研究，2019，27（10）：101-102.

[11]丛林.控释三酸修护敷料治疗面部轻中度寻常痤疮及改善皮肤屏障的功效评价[J].中国美容医学，2020，29（10）：89-92.

[12]李海秀，覃骊兰，郝二伟.痤疮动物模型的研究进展[J].大众科技，2022，24（7）：5.

[13]American Academy of Dermatology invitational symposium on comedogenicity[J].J Am Acad Dermatol，1989，20：272-277.

[14]Dessinioti C，Katsambas A D.The role of Propionibacterium acnes in acne pathogenesis： facts and controversies[J].Clin Dermatol，2010，28（1）：2-7.

[15]劉文彬，王晖.痤疮模型的研究现状[J].广东药学院学报，2010，26（2）：7.

[收稿日期]2022-12-26

本文引用格式：杨力，刘尚可，林新瑜，等.超分子水杨酸对兔耳痤疮模型p38MAPK/NF-κB信号通路的影响[J].中国美容医学，2024，33（3）：1-5.