仙茅苷对大鼠骨髓基质细胞体外增殖及成骨分化的影响①

苏佳雨,王锡明,赵 刚,石金明,李 超,柴傲然

(1.佳木斯大学研究生学院,黑龙江 佳木斯 154007;2.大庆油田总医院,黑龙江 大庆 163000;3.佳木斯大学附属第二医院,黑龙江 佳木斯 154002)

骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是骨髓中特殊的干细胞,有很强的增殖能力和多向分化能力[1],在特定的诱导条件下能够向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、成纤维细胞、神经细胞等分化[2-4]。诱导物在BMSCs向成骨方向分化、成骨能力的提高中有着重要的作用[5]。而今已经有多项研究表明多种中药可以促进骨髓基质细胞的增殖并且诱导其分化为成骨细胞。

中药仙茅是多年生的草本植物,来源于石蒜科草本植物仙茅(curculigo orchioides gaertn)的干燥根茎,仙茅的药用历史悠久,有补肾壮阳、强筋壮骨、祛除寒湿的功效[6]。药理学研究表明仙茅具有提高免疫、清除氧自由基、减缓生殖系统的老化、保护心血管等多种作用,并且在抗骨质疏松方面也有着一定的作用[7]。仙茅苷(curculigoside,CCG)是仙茅主要的活性成分[8]。

本实验将不同浓度的仙茅苷作用于体外培养的大鼠骨髓基质细胞,观察仙茅苷对细胞的增殖和向成骨方向分化的影响,探讨仙茅苷在 BMSCs 成骨性分化中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料:4～6周龄SD大鼠,佳木斯大学动物实验中心提供。仙茅苷(上海金穗生物科技HPLC≥98%),DMEM培养基(HyClone),胎牛血清(GIBCO),地塞米松、β一甘油磷酸钠、维生素C(均为GIBCO公司),胰蛋白酶(HyClone), CCK-8试剂盒(BOSTER博士德生物),碱性磷酸酶试剂盒(购自南京建成)。

1.1.2 主要仪器设备:CO2恒温细胞培养箱(美国ThermoForma),超净工作台(苏州明泰空气净化技术有限公司),电子分析天平(Ohaus,美国),倒置相差显微镜(Olympus,日本),酶标仪(Takara,日本)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓基质细胞的分离与培养

无菌条件下分离出大鼠的股骨、胫骨,将表面附着的组织去净,剪去两侧骺端,显露髓腔,用注射器吸取培养液冲洗髓腔,直到髓腔发白。将细胞转移到离心管中,1000r/min离心10min,弃掉上清液,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液,混匀后接种于培养瓶,置于37℃、体积分数5%的CO2培养箱内培养,48h后换液,去除悬浮未贴壁的细胞,以后每3d更换培养液。 细胞达到80%融合以上时,加入0.25%的胰蛋白酶进行消化,按1:2比例传代。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖

将生长良好稳定的第3代BMSCs以5×104/mL的密度接种于96孔板,每孔的液量为100μL,37℃、5%CO2培养箱中培养 24h后,弃培养液,加入含CCG的终浓度为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL,200μg/mL的培养液,等量的DMEM培养液作为对照孔,置于培养箱中培养。在培养1、4、7d后,加入CCK-8试剂, 放于培养箱中继续孵育4h后,用酶标仪测定波长在450nm下每孔的吸光度(OD值)。

1.2.3 碱性磷酸酶活性(ALP)测定

将第三代BMSCs以5×104/mL的密度接种于96孔板中,第二天换不同培养液, 共分6组,对照组:含10%FBS的DMEM培养液组;成骨诱导液组(含10%胎牛血清的DMEM培养液中加入0.1μmol/L地塞米松、50μg/mL维生素C、10mmol/Lβ一甘油磷酸钠);分别含终浓度为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的仙茅苷+成骨诱导液组。在培养3、6、9d后按照ALP试剂盒操作进行检测。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 CCK-8 检测细胞增殖

各组随着时间的增加BMSCs不断增殖,各浓度仙茅苷组(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL,200μg/mL)均能够促进细胞的增殖,与对照组相比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中以浓度为100μg/mL的作用最显著,见表1。

表1 仙茅苷对各组BMSCs增殖的影响

2.2 碱性磷酸酶活性测定

诱导后的第3、6、9d,成骨诱导液组和仙茅苷+成骨诱导液组的ALP活性均显著升高(P<0.05),且在仙茅苷浓度为100μg/mL时效果最好。而仙茅苷+成骨诱导液组效果优于成骨诱导液组,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 仙茅苷对各组BMSCs 碱性磷酸酶活性的影响

3 讨论

随着正畸技术的发展和进步,以及人们对生活质量要求的提高,对牙齿的美观也越来越在意,成年人在正畸患者中的比例日趋增多[9],而其中一部分患者存在慢性牙周病,正畸治疗可能会导致牙槽骨的吸收变快。而牙周病患者必须在牙周病静止期,牙槽骨的吸收不超过1/2,炎症被有效的控制时才能采取正畸治疗[10]。由牙周病所致的牙槽骨缺损以及肿瘤、外伤、先天等因素导致的颌骨骨组织缺损很常见,颌骨的修复始终是口腔临床医学上的难点,一般的修复手段不能起到很好的疗效,骨组织工程的进展使得骨缺损的修复有了新的转机。骨组织工程的重要环节之一是种子细胞的选择,由于骨髓基质细胞有多向分化的潜能并且在体外能够大量增殖,将成为前景最为理想的细胞[11]。中药作为祖国传统医学的一部分,由于毒副作用小并且容易吸收,常用于对骨损伤的治疗[12]。近些年,多项研究显示通过中药来促进BMSCs的增殖以及诱导其分化是很有效的途径[13]。

不同浓度CCG干预BMSCs后,CCK-8实验结果显示,25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的仙茅苷均能促进骨髓基质细胞的增殖,而在浓度为100μg/mL时的促增值效果最显著。碱性磷酸酶是成骨细胞表面的标志性酶,其表达随着分化程度的增加而增强,它是BMSCs定向成骨分化的重要评价指标。碱性磷酸酶活性检测结果显示,在定向诱导成骨的条件下,仙茅苷显著的提高了ALP的活性,且浓度为100μg/mL时作用最明显,表明仙茅苷对大鼠骨髓基质细胞的成骨分化能力有着积极的作用。

本实验将不同浓度的仙茅苷作用于体外培养的大鼠骨髓基质细胞,通过细胞增殖实验和对成骨分化的标志性酶的检测,发现仙茅苷可促进大鼠骨髓基质细胞的增殖,并且促进其成骨方向分化,但其更深层的机制还有待进一步的研究。