基于PI3K-AKT-mTOR信号通路探讨灵芝孢子对2型糖尿病大鼠睾丸的保护作用①

逄瑞丰,王肖烨,宣金雨,毕九丁,孔维明,郝婉莹,马小茹

(佳木斯大学医学部,黑龙江 佳木斯 154007)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种全身性、慢性、代谢性疾病,由遗传因素和环境因素长期共同作用所导致。我国糖尿病患者人数位居世界榜首且有年轻化趋势[1],糖尿病可导致机体代谢紊乱从而产生许多并发症,有研究表明,糖尿病患者都会出现不同程度的生殖系统障碍,如性欲下降、精液质量下降、勃起功能障碍、逆行射精等[2]。因此糖尿病导致的男性不育问题也逐渐被人们广泛关注。睾丸是雄性生殖器官之一,是精子产生的场所,睾丸的健康与精子质量息息相关,其对男性生殖功能极为重要。

PI3K-AKT-mTOR通路是人体调节细胞周期重要通路之一,在细胞存活、增殖和蛋白质合成中起重要作用。在调控男性生殖系统方面也发挥着重要的作用,其不仅参与影响下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴功能[3],还通过调节精原细胞的增殖分化、精母细胞的减数分裂、精子的发生和睾丸体细胞的功能来影响精子发生的过程[4]。同时该通路也可以在自噬与凋亡的调控中来维持睾丸生精微环境的稳态[5,6]。有研究表明,2型糖尿病通过激活PI3K-AKT信号通路,降低了睾丸中血管内皮生长因子(VEGF)的表达,破坏睾丸微循环导致了睾丸形态改变、细胞凋亡水平异常和精子发生障碍[7]。

灵芝孢子是灵芝喷射出的生殖细胞即灵芝的种子,其有灵芝多糖、灵芝三萜等有效成分,具有降脂降糖、提高免疫力、抗炎症和抗氧化等多种功效,是被人们广为运用的保健品之一。有研究表明,灵芝孢子对糖尿病可以起到预防作用,同时也对多种糖尿病的并发症如糖尿病肾病、糖尿病心肌病、糖尿病足等具有较好的治疗作用[8]。在糖尿病男性生殖功能障碍方面,灵芝孢子可以通过调节氧化应激和改善线粒体损伤来改善糖尿病大鼠的勃起功能障碍[9],因此,使用灵芝孢子改善男性生殖功能障碍前景可观。

灵芝孢子对人的体细胞与生殖细胞的DNA均有保护作用,但灵芝孢子是否通过PI3K-AKT-mTOR通路对2型糖尿病导致的睾丸损伤有保护作用尚未发现有关报道,因此本实验通过建立2型糖尿病大鼠模型,灵芝孢子灌胃干预,观察2型糖尿病对大鼠睾丸的损伤作用以及灵芝孢子对其的保护作用,并探讨可能机制,为发掘灵芝孢子潜在药用价值及治疗男性不育提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:清洁级雄性SD大鼠40只,体质量170～220g,购自哈尔滨医科大学动物实验中心(实验动物许可证号:SYXK(黑)2016-014),饲养于佳木斯大学实验动物中心,温度(24±2)℃,湿度40%～60%,每日日照12h,自由饮食饮水。本实验方案通过佳木斯大学动物实验伦理委员会批准,编号为 No.216-JMSU。

1.1.2 主要试剂与药品:STZ购自Sigma公司;灵芝孢子购自上海源叶生物科技有限公司;磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)抗体、磷酸化磷脂酰肌醇 3-激酶(p-PI3K)抗体购自英国Abcam公司;丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)抗体、磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶(p-AKT)抗体、雷帕霉素受体蛋白(mTOR)抗体、磷酸化雷帕霉素受体蛋白(p-mTOR)抗体购自美国CST公司;SOD、MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与造模:40只雄性SD大鼠适宜温度、湿度适应性饲养1周后开始实验,随机分为正常(NC)组(n=10),高脂高糖饮食(HF)组(n=10),糖尿病(DM)组(n=10),灵芝孢子干预(GLSP)组(n=10)。高脂高糖饲料(配方:基础饲料粉末:白砂糖:猪油:蛋黄=59:20:17:4)喂养HF组、DM组、GLSP组,喂养4周后DM组、GLSP组禁食12h,腹腔注射STZ(30mg/kg),随后分别在第3、7天检测大鼠空腹血糖(FBG),若连续两次FBG≥16.8mmol/L则造模成功,首次造模不成功以STZ(15mg/kg)进行二次补注,造模成功后GLSP组以灵芝孢子300mg/(kg·d)灌胃共计12周,NC组、HF组、DM组以等量生理盐水灌胃连续12周。

1.2.2 各组大鼠标本留取:饲养期间每日观测各组大鼠精神状态、饮食饮水情况、毛色变化、尿量。每周测定一次FBG与体质量,在末次给药后禁食12h再测定一次FBG,实验结束后腹腔注射3%戊巴比妥钠45mg/kg溶液麻醉处死大鼠,取血于-80℃保存备用,分离两侧睾丸,冰生理盐水冲洗、滤纸拭干后称重,保存于-80℃冰箱。整个过程均在冰上操作。

1.2.3 各组大鼠精子形态观测:大鼠麻醉处死后取附睾尾置于装有4mL,37℃的EP管中剪碎,使精子充分游出,再将悬浊液置于65℃水浴锅内10min消除精子活性,取精子悬浊液涂片、干燥、固定、染色。低倍镜下观察视野内精子密度,高倍镜下观察精子形态。

1.2.4 SOD与MDA测定:取睾丸组织,充分剪碎研磨离心制备组织匀浆,以试剂盒说明书为准分别进行SOD与MDA检测操作,使用酶标仪测定并记录OD值。

1.2.5 Western bolt法检测蛋白表达水平:取出保存于-80℃冰箱的睾丸组织置于冰盒上,稍微解冻后剥离组织外膜及周围脂肪,称量0.1g置于1.5mL离心管中并加入组织裂解液1mL、10μL蛋白酶抑制剂,用眼科剪剪碎,置于玻璃研磨器中充分研磨后使用细胞超声破碎机进行超声破碎5次,置于4℃静置1h。于离心机以4℃、15000r离心15min取上清,BCA法测蛋白浓度。按比例加入蛋白上样缓冲液(6×buffer),100℃沸水浴10min。制胶、上样(30μg/孔)后进行电泳(恒压80V至maker出红线后转换恒压120v)、转膜(恒流260mA)、实验级脱脂奶粉封闭(37℃,1.5h)、TBST洗净后分别加入PI3K(1:1000)、p-PI3K(1:1500)、AKT(1:1500)、p-AKT(1:1000)、mTOR(1:1500)、p-mTOR(1:1500)抗体4℃孵育过夜,洗净后加入对应二抗,ECL显色法检测大鼠睾丸组织PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表达情况,再用image1.8.0软件分析条带光密度值。

1.3 主要观察指标

各组大鼠体质量及睾丸质量、空腹血糖、精子形态、睾丸组织氧化应激水平,PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表达情况。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 受试实验动物数量分析

实验共选用40只雄性SD大鼠,分为正常组、高脂高糖饮食组、糖尿病组、灵芝孢子干预组,每组10只。在复制2型糖尿病模型期间,糖尿病组有1只大鼠死亡,可能与腹腔注射时针头穿破肠道有关,最终共计39只大鼠进入结果分析。

2.2 各组大鼠状态

NC组大鼠在整个实验过程中精神饱满,饮食饮水情况正常,毛色顺滑,活动情况正常,尿量正常。HF组大鼠前期情况与NC组无较大差距。实验中后期,该组大鼠体型硕大,饮食饮水较多,毛发粗糙,活动情况不佳。DM组大鼠体型瘦小,毛色暗黄粗糙且没有光泽,饮水情况增加,尿量增加,呈现典型的“三多一少”状态,反应迟钝,精神萎靡。GLSP组大鼠情况较DM组有所改善,尿量减少,精神状态尚可。

2.3 各组大鼠末次FBG情况

结果显示,与NC组及HF组相比,DM组大鼠血糖值显著升高(P<0.01),经灵芝孢子干预后,血糖值较DM组显著降低(P<0.01),NC组与HF组血糖值无明显差异(P>0.05)。提示灵芝孢子对糖尿病大鼠有显著的降血糖效果,见图1。

注:与正常组比较**P<0.01,与糖尿病组比较##P<0.01。

2.4 各组大鼠体质量及睾丸质量情况

结果显示,DM组大鼠的体质量与睾丸质量明显较NC组与HF组降低(P<0.01),经灵芝孢子灌胃干预后,GLSP组大鼠体质量及睾丸质量较DM组明显升高,有明显的统计学意义(P<0.01),见图2。

注:与正常组比较**P<0.01,与糖尿病组比较##P<0.01。

2.5 各组大鼠精子形态

经染色后观察发现,低倍镜下NC组与HF组大鼠精子密集,DM组大鼠精子数目稀少,经GLSP干预后数目有所好转。高倍镜下观察发现NC组与HF组大鼠有较多正常形态精子,DM组大鼠精子形态有较多异常,如断头、无头、卷曲等,见图3,4。

图3 各组大鼠精子形态(100×)

图4 各组大鼠精子形态(400×)

2.6 各组大鼠SOD、MDA情况

结果显示,DM组大鼠SOD水平较NC组明显降低(P<0.01),MDA水平明显增高(P<0.01),经灵芝孢子干预后,GLSP组大鼠的SOD与MDA水平较DM组大鼠有明显好转(P<0.05,P<0.01),见图5。

注:与正常组比较**P<0.01,与糖尿病组比较#P<0.05,##P<0.01。

2.7 Western boltting法检测PI3k-Akt-mTOR信号通路蛋白表达水平

Western boltting结果显示,DM 组大鼠睾丸组织 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 和 pmTOR/mTOR 蛋白水平显著高于 NC 组(P<0.01),HF 组大鼠睾丸 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 以及 p-mTOR/mTOR 蛋白水平显著低于 DM组(P<0.01,P<0.05,P<0.01),有明显统计学差异。经灵芝孢子治疗后,GLSP组大鼠p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 和 p-mTOR/mTOR 蛋白水平较DM组显著降低(P<0.05)。可见灵芝孢子具有明显的降低PI3K-AKT-mTOR信号通路蛋白磷酸化水平,见图6。

注:与正常组比较**P<0.01,与糖尿病组比较#P<0.05,##P<0.01。

3 讨论

纵观全球,糖尿病发病率持续上升,我国糖尿病患病率也呈逐渐攀升趋势[10],糖尿病所致的男性生殖障碍是当今关注的热点。睾丸是男性重要的生殖器官,既往诸多临床和动物实验数据表明糖尿病会对睾丸造成损伤,降低男性生殖功能。灵芝孢子是灵芝的种子,主要包括多糖类、生物碱类、三萜类化合物、蛋白质,核苷和核苷酸等,具有抗糖、抗氧化、抗炎、抗衰老以及免疫调节、调控肠道菌群等药理作用,是中医药中极为重要的药用产品,具有很高的药用和养生保健食疗价值。

有研究发现,糖尿病是勃起功能障碍和其他男性性功能障碍的危险因素之一,影响着男性生殖系统的健康,与男性不育息息相关[11,12]。实验结果显示,DM组大鼠较NC组而言体质量、睾丸质量明显降低,血糖明显升高,且精神萎靡,反应迟钝,尿量增多,体态消瘦。灵芝孢子灌胃干预后大鼠体质量和大鼠睾丸质量都增加,血糖下降,精神状态逐渐有所恢复,毛色逐渐变淡,毛发逐渐顺滑,尿量减少,活动增加,说明灵芝孢子发挥降糖作用且在糖尿病导致的睾丸损伤中起到积极方面作用。

精子的健康状态可直接反应雄性生殖功能的水平,异常的精子形态会影响精子活动能力而导致受精失败。在本实验中可发现NC组与HF组的精子数目密集、高倍镜下较大部分的精子形态正常,而DM组大鼠精子数目稀疏,高倍镜下发现较大部分精子形态异常,出现无头、断头、断尾、卷曲等畸形现象,而经灵芝孢子干预后该现象有所好转,说明糖尿病可直接影响精子的数目以及形态,而灵芝孢子可改善糖尿病导致的这一负面现象。

氧化还原平衡对于维持精子功能的各个重要方面至关重要,精子细胞膜含有大量的多不饱和脂肪酸,这使得它们对氧化损伤非常敏感[13],当抗氧化物的数量并不足以与其拮抗时会形成过氧化产物从而对机体造成伤害,导致膜完整性的丧失,DNA损伤,线粒体功能障碍,精子数量减少,活力下降等造成男性不育[14]。SOD是清除ROS的主要酶, MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一,其直接反应机体被自由基侵袭的程度。在本实验中的结果显示,与NC组相比DM组大鼠MDA含量显著升高,SOD含量显著下降。灵芝孢子灌胃治疗后MDA含量下降,SOD含量上升,说明在DM状态下,睾丸组织内部氧化应激水平增加,组织器官氧化损伤。灵芝孢子干预后大鼠睾丸组织内部氧化因子释放减少,抗氧化物酶含量增加,提示灵芝孢子具有抗氧化的功能,可以保护糖尿病大鼠睾丸损伤与通过改善氧化应激水平存在显著相关性。

PI3K/AKT/mTOR 通路被认为在调节葡萄糖摄取和糖原合成的胰岛素信号通路中起关键作用[15]。于此同时,该通路也与精子发生成熟息息相关[16]。该通路是自噬的负调控轴,mTOR是该通路的下游蛋白[16],被誉为细胞自噬的抑制剂。一项研究[16]中发现通过STZ联合高脂高糖饮食制备的糖尿病肾病模型中PI3K/AKT/mTOR 信号通路磷酸化蛋白表达水平显著上调,自噬相关蛋白表达明显下降,凋亡水平活跃,炎症水平增高,出现了肾脏损伤和功能障碍,而在糖尿病睾丸损伤中尚未有相关报道。在本实验中,DM组p-PI3k、p-AKT、p-mTOR水平较NC组显著升高,表明该信号通路被激活,灵芝孢子干预后,p-PI3k、p-AKT、p-mTOR水平较DM组显著下调,这提示着灵芝孢子对糖尿病睾丸起保护作用可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路进而重新激活自噬有关。

本实验中HF组的血糖水平未明显上升,但大鼠体质量明显增加,氧化应激水平增加,且通过PI3K/AKT/mTOR 通路蛋白的检测发现HF组与DM组之间依然有明显差异。推测单纯的高脂高糖饮食尚不能构成糖尿病模型,还需进一步探究讨论。

综上所述,本实验利用灵芝孢子灌胃干预糖尿病大鼠,可以有效改善DM大鼠一般情况,降低DM大鼠血糖,增加DM大鼠体质量和睾丸质量,降低DM大鼠的氧化应激水平,降低DM大鼠p-PI3k、p-AKT、p-mTOR水平。灵芝孢子对DM睾丸损伤具有明显保护作用,其机制可能与抑制 PI3K/AKT/mTOR 信号通路,降低氧化应激水平有关。