基于网络药理学与分子对接探讨运脾化湿清肺汤治疗特应性皮炎的作用机制*

常秋伊,倪骥杰,宋瑜

1.上海浦东新区光明中医医院,上海 201399; 2.上海市闵行区浦江社区卫生服务中心,上海 201112;3.上海中医药大学附属龙华医院,上海 200032

特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)属于临床常见的皮肤病之一,是一种反复发作的慢性、炎症性、非传染性疾病,以剧烈瘙痒、皮肤干燥和反复发作的湿疹样皮炎等为主要表现。全球范围内,超过20%的儿童和3%的成人罹患AD[1]。近20年来,我国AD的发病率呈现逐年上升的趋势[2-3]。

AD病因复杂,仅以抗过敏药物联合外用激素药膏治疗往往疗效不佳。运脾化湿清肺汤是根据上海市名中医马绍尧多年临床经验总结而成。临床研究表明,运脾化湿清肺汤治疗60例AD患者的临床有效率达100%,并可降低血清白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、可溶性IL-2 受体(soluble IL-2 receptor,sIL-2R)水平[4-5],但具体机制及作用靶点尚不明确。因此,本研究基于网络药理学与分子对接方法,筛选运脾化湿清肺汤的活性成分,分析其治疗AD的信号通路及核心靶点,为后续基础和临床研究提供思路和方向。

1 资料与方法

1.1 运脾化湿清肺汤活性成分及作用靶点筛选通过中药网络药理学分析系统(TCM network pharmacology analysis system,TCMNPAS)v1.0[6](http：//54.223.75.62：3838/)检索运脾化湿清肺汤(陈皮、枳壳、桑叶、菊花、金银花、黄芩、土茯苓、白鲜皮、白术、甘草)的活性成分和作用靶点,以定量评估类药性(quantitative estimate of drug-likeness,QED)阈值为0.2进行筛选[7],数据库来源为中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)、中药综合数据库(traditional Chinese medicines integrated database,TCMID)、草药成分和靶标数据库(herbal ingredients′ targets platform,HIT);查阅已发表文献中运脾化湿清肺汤所含药物的活性成分和作用靶点[8]。运用Cytoscape 3.8.0软件构建“药物-活性成分-作用靶点”网络。

1.2 AD疾病靶点筛选以“atopic dermatitis”(疾病编号：C0011615)为关键词,通过GeneCards(https：//www.genecards.org/)数据库、DrugBank(https：//www.drugbank.ca/)数据库获取AD疾病靶点,GeneCards数据库的检索结果中去除Score中位数以下的靶点;查阅已发表文献中AD的疾病靶点,从而筛选运脾化湿清肺汤治疗AD的靶点。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络构建及核心靶点筛选利用jvenn平台(http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)[9]获取运脾化湿清肺汤与AD的交集靶点并绘制韦恩图。将交集靶点上传至STRING数据库(https：//string-db.org/),物种设置为“Homo sapiens”,最低相互作用阈值设为0.4,不隐藏游离节点,得到PPI网络。将PPI网络导入Cytoscape 3.8.0软件,使用Analyze Network插件进行拓扑分析,选取同时满足高于平均自由度、平均中介中心性、平均接近中心性且低于平均最短路径长度的靶点,作为运脾化湿清肺汤治疗AD的核心靶点。

1.4 基因本体(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析基于运脾化湿清肺汤与AD的交集靶点,通过Metascape数据库(http：//metascape.org)进行GO功能分析(P<0.01,富集因子>1.5)和KEGG通路分析(P<0.01,富集因子>1.5)。借助imageGP平台(https：//www.bic.ac.cn/BIC/)绘制条形图和气泡图。将10个中药、15个交集靶点以及KEGG通路导入Cytoscape 3.8.0软件,共同构建“药物-靶点-通路”网络。

1.5 分子对接将运脾化湿清肺汤分为运脾药组(陈皮、枳壳、白术)、化湿药组(土茯苓、白鲜皮)、清肺药组(黄芩、金银花、桑叶、菊花)三类,取每组药物中QED值排名前3位的活性成分作为配体;将核心靶点作为受体,通过PDB数据库(http：//www.rcsb.org/)获取受体蛋白的PDB ID,物种设置为“Homo sapiens”。基于TCMNPAS v1.0数据库,采用PSOVina算法[10]对活性成分和核心靶点进行分子对接验证,并采用PyMOL软件进行可视化展示。

2 结果

2.1 运脾化湿清肺汤活性成分及作用靶点通过TCMNPAS v1.0数据库及文献检索得到运脾化湿清肺汤活性成分243个、作用靶点344个;检索TCMID数据库,暂未发现运脾化湿清肺汤经水煎煮后出现新的活性成分。采用Cytoscape 3.8.0软件构建“药物-活性成分-作用靶点”网络,该网络包含612个节点和4 458条边,节点越大,表明度值越大,见图1。

注：CP：陈皮;ZK：枳壳;SY：桑叶;JH：菊花;JYH：金银花;HQ：黄芩;TFL：土茯苓;BXP：白鲜皮;BZ：白术;GC：甘草;六边形节点为活性成分,紫色菱形节点为作用靶点。

2.2 运脾化湿清肺汤治疗AD的潜在靶点通过GeneCards数据库、DrugBank数据库筛选出AD疾病靶点145个。利用jvenn平台绘制药物作用靶点与AD疾病靶点的韦恩图,得到15个交集靶点,可能是运脾化湿清肺汤治疗AD的潜在靶点,见图2、表1。

图2 运脾化湿清肺汤作用靶点与AD疾病靶点的韦恩图

2.3 PPI网络及核心靶点通过STRING数据库构建15个交集靶点的PPI网络,该网络包含15个节点和58条边,见图3;拓扑分析显示,各节点的平均度值为7.733,平均最短路径长度为1.467,平均中介中心性为0.036,平均接近中心性为0.707;根据这些指标进一步筛选得到4个核心靶点,节点越大,则表明度值越大,见表2。

表2 运脾化湿清肺汤治疗AD的核心靶点信息

图3 运脾化湿清肺汤治疗AD的PPI网络图

2.4 GO和KEGG富集分析通过Metascape数据库进行GO功能分析,筛选得到421个生物过程(biological process,BP),主要包括对细菌的应答、对脂多糖的应答、细胞对生物刺激的反应等;8个细胞组分(cellular component,CC),主要包括膜筏、初级内体、细胞质膜蛋白复合物等;7个分子功能(molecular function,MF),主要包括细胞因子受体结合、转录因子结合、肽结合等,见图4。通过Metascape数据库筛选得到55条KEGG通路,主要涉及炎症信号通路(TNF信号通路等)、各类传染性疾病(如克氏锥虫、弓形虫、疟疾)、病毒感染(如单纯疱疹病毒)等,排名前9位的KEGG通路见图5。采用Cytoscape 3.8.0软件构建“药物-靶点-通路”网络,节点越大,度值越大,见图6。

图4 GO富集分析条形图

图5 KEGG富集分析气泡图

注：CP：陈皮;ZK：枳壳;SY：桑叶;JH：菊花;JYH：金银花;HQ：黄芩;TFL：土茯苓;BXP：白鲜皮;BZ：白术;GC：甘草;蓝色节点为作用靶点,紫色节点为信号通路。

2.5 分子对接将运脾药组、化湿药组、清肺药组中QED值排名前3位的活性成分作为配体,见表3;将核心靶点IL-6、TNF、CXCL8、MAPK1作为受体蛋白,利用TCMNPAS v1.0数据库进行分子对接。研究显示,配体与受体的最低结合能≤-5.0 kJ·mol-1说明两者的亲和性较好,最低结合能≤-7.0 kJ·mol-1说明两者的结合构型极稳定[11]。结果显示,活性成分与核心靶点的最低结合能基本≤-5.0 kJ·mol-1,其中最低结合能≤-7.0 kJ·mol-1的占53.13%,说明两者具有较好的亲和性和结合能力,见表4。使用PyMOL软件对最低结合能排名前6位的结果进行可视化展示,见图7。

表3 运脾药组、化湿药组、清肺药组的主要活性成分

表4 三大药组主要活性成分与核心靶点分子对接最低结合能kJ·mol-1

注：A：陈皮素与TNF;B：孕烷醇酮与TNF;C：黄芩黄酮I与TNF;D：陈皮素与MAPK1;E：孕烷醇酮与MAPK1;F：黄芩黄酮I与MAPK1。

3 讨论

马绍尧教授总结历代医家理论及自身临床经验,提出AD常见于儿童和青少年,其发病与小儿的生理和病理特点相关,尤与“肺常不足”“脾常不足”关系密切。马绍尧教授提出“肺脾同调”的论治原则,并创制运脾化湿清肺汤。方中陈皮、枳壳为君药,意在健运脾胃,使补而不滞;同时,两药味皆辛、苦,具有能散、能行的特点,药后使脾气升而胃气降,脾气运而湿气去;金银花、黄芩为臣药,泻上焦之火,散风热、清肺化湿;桑叶、菊花皆疏风散热、清肝明目,两药共用,以辛凉轻剂清除肺热;土茯苓解毒除湿,白术健脾燥湿和中,两者共奏培土健运燥湿之效;白鲜皮祛风燥湿、清热解毒,为祛风止痒之要药,上五味共为佐药;甘草调和诸药。全方标本同治、肺脾同调,共奏健脾祛湿、清肺解毒之功。

药理学研究表明,运脾化湿清肺汤组成药物所含的化学成分在减轻炎症、调节免疫等方面具有显著作用。例如,黄芩中的乙酸乙酯和黄芩素能有效改善AD小鼠的皮损症状,并抑制血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平升高[12];陈皮、枳壳所含的陈皮素可有效抑制变态反应过程中多种转录因子活化,降低白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、TNF-α水平,抑制免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)升高[13];桑叶、菊花水煎剂能降低血清白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、一氧化氮(nitric oxide,NO)及髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)含量从而抑制炎症反应[14]。这与本研究得出的运脾化湿清肺汤活性成分、作用靶点结果相类似。

既往研究表明,AD的发生发展主要与皮肤屏障功能障碍、免疫应答异常、皮肤病原菌定植、遗传基因突变及环境变化等因素密切相关。其中,免疫应答异常被认为是AD发病过程中的重要环节。富集分析结果显示,运脾化湿清肺汤治疗AD的作用途径主要与抗炎、抗病毒、调节免疫、调节代谢等有关,以TNF信号通路、叉头框蛋白O(forkhead box protein O,FoxO)信号通路、低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)信号通路与AD的关系密切。TNF信号通路主要与Toll样受体产生炎症因子(如IFN-β、TNF)触发细胞凋亡以及TNF受体相关因子(TNF receptor-associated factor,TRAF)介导的核转录因子-κB (nuclear transcription factor-κB,NF-κB)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)活化相关。TNF参与诱导炎症反应,NF-κB也是与AD相关的炎症通路之一[15]。FoxO与自身免疫性疾病关系密切,其活化受到磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)调节。FoxO活化后可同时调节B淋巴细胞和T淋巴细胞免疫等,包含由信号转导因子和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)介导的Janus激酶(Janus kinase,JAK)/STAT信号通路,产生IL-6、IL-10等炎症因子[16-17]。HIF-1信号通路在机体缺氧情况下会持续表达HIF-1α,通过调控Bcl2/腺病毒E1B 19 kD相互作用蛋白3(Bcl2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3,BNIP3)等产生大量Bcline-1,进而影响自噬体形成[18]。研究表明,炎症性疾病会产生大量HIF-1α,其在炎症因子IL-1β和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的合成、表达中起着重要的调控作用[19]。

综上所述,运脾化湿清肺汤可能通过多种活性成分、多个靶点及多条信号通路作用于AD。其中,化湿药组(白鲜皮)和清肺药组(黄芩)所含的化学成分呈现出较高的类药性和活性,推测其可能是运脾化湿清肺汤治疗AD的重要活性成分。本研究为运脾化湿清肺汤治疗AD的单药研究、拆方研究和机制研究提供了一定的理论依据和研究思路。