基于电子舌技术研究蜜炙枇杷叶配方颗粒的“炮制痕迹”

奉 梅，徐 杨，时小东，杨文蓉，邓梦雨，李秭钰，刘 涛,3，罗 勇，徐玉玲,3*

1.成都大学药学院，四川 成都 610106

2.成都大学食品与生物工程学院，四川 成都 610106

3.四川省抗病毒中药产业化工程技术研究中心，四川 成都 610106

4.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001

枇杷叶为蔷薇科枇杷属植物枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.) Lindl.的叶，临床上有蜜炙枇杷叶和枇杷叶2 种饮片，枇杷叶有清肺止咳、和胃利尿、止渴的功效，而蜜枇杷叶则起到治疗肺热咳嗽、气逆喘急、胃热呕逆的作用，两者功效不同。中药炮制是指在中医理论的指导下，按中医用药要求将中药材加工成中药饮片的传统方法和技术，是中医药临床用药的特色之一。炮制前后部分化学成分会发生变化，药效也会产生一定差异[1-3]。研究表明，枇杷叶经蜜炙后，其醇溶性浸出物增多[4]。鲁湘鄂等[5]采用气相色谱-质谱法对枇杷叶饮片炮制前后的挥发油进行化学成分的分析，证明了枇杷叶蜜炙前后挥发油水平上存在差异，汪世浩等[6]通过紫外光谱技术研究发现，蜜炙后的枇杷叶饮片的总三萜含量明显增加。叶广亿等[7]通过对生枇杷叶和炙枇杷叶的水提物、醇提物止咳化痰平喘作用进行比较，结果表明，蜜炙枇杷叶的止咳化痰平喘总体效果明显优于生枇杷叶。

枇杷叶饮片蜜炙前后可以从饮片性状进行有效的区别，但当其制备为配方颗粒后由于经过提取、浓缩、干燥等工艺，颗粒丧失了原饮片的物理特征，不能通过性状进行辨识[8]。由于2 种配方颗粒的现行标准没有差异性，无法以检识其原料是否经过炮制，而不同炮制品的枇杷叶配方颗粒（Eriobotryae Foliumformula granules，EF-FG）临床功效不同，适应证有异，临床不能混用。由于蜜炙枇杷叶生产成本较高，在配方颗粒生产过程中投料造假，用非炮制品原料替代炮制品原料等乱投料生产的现象时有发生，影响了药品的安全性和有效性，对中药配方颗粒产业的良性发展带来了潜在不良影响。

ASTREE 型电子舌是一种仿生人体舌头的智能味觉感官系统，由味觉传感列阵及信号处理、识别系统组成的智能仪器技术，其工作原理类似于人类味蕾[9]。分类主要有电位分析、伏安分析、电导分析及生物传感器电子舌，目前已广泛应用到食品及药品领域[10-14]。

本实验采用电子舌技术，对EF-FG 及蜜枇杷叶配方颗粒（honey-friedEriobotryaeFoliumformula granules，HEF-FG）的各滋味进行测定，结合多元统计模式识别分析方法，探讨枇杷叶蜜炙前、后制成配方颗粒其本身滋味的改变，并以此为基础，通过对EF-FG 与HEF-FG“炮制痕迹”的研究，为中药配方颗粒质量标准无法检识原料是否炮制的问题提供解决思路。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BS-6KII 型电子分析天平，上海友声衡器有限公司；ASTREE 型电子舌，法国Alpha MOS 公司；TG20G 型离心机，天津广丰科技公司；PS-40 型超声波清洗器，深圳得康清洗设备有限公司。

1.2 试剂与材料

0.01 mol/L 氯化钠、0.01 mol/L 谷氨酸钠、0.01 mol/L 盐酸，法国Alpha MOS 公司；怡宝蒸馏水，华润怡宝饮料（控股）有限公司。

本实验样品EF-FG 与HEF-FG 为自制配方颗粒，枇杷叶药材选择标准为不同的枇杷树上大小相近颜色相近的叶子，经成都大学郭晓恒副教授鉴定，为蔷薇科枇杷属植物枇杷E.japonica(Thunb.) Lindl.的新鲜叶。枇杷叶药材样品详细信息见表1。

表1 枇杷叶药材和枇杷叶、蜜枇杷叶饮片及其配方颗粒样品信息Table 1 Information of Eriobotryae Folium medicinal herbs, and Eriobotryae Folium decoction pieces, honey-fried Eriobotryae Folium decoction pieces, and its formula granules samples

枇杷叶饮片、蜜枇杷叶饮片根据《中国药典》2020 年版一部“枇杷叶”项下和四部炮制通则项下的蜜炙法炮制（蜜枇杷叶饮片蜜炙时，枇杷叶饮片-炼蜜5∶1）而成，具体信息见表1。

EF-FG 及HEF-FG 均按照《中药配方颗粒国家标准公示》制成。配方颗粒样品详细信息见表1。

2 方法与结果

2.1 EF-FG 及HEF-FG 的制备

取枇杷叶（蜜枇杷叶饮片）100 g，加入2 000 mL水，静置30 min 后煎煮，待沸后，保持微沸状态继续煎煮30 min，滤过，滤渣再次加入2 000 mL 水，煎煮，待沸后，保持微沸状态继续煎煮30 min，滤过，合并2 次煎液。滤液于80 ℃下浓缩成清膏，加入糊精辅料适量，混匀，于80 ℃下减压干燥，再加糊精辅料适量（使得最终干浸膏-辅料1∶1），混匀，制粒，即得EF-FG 及HEF-FG。

2.2 电子舌技术检测EF-FG 及HEF-FG 的电子滋味

2.2.1 电子舌技术检测条件 采用蒸馏水和0.01 mol/L 盐酸水溶液进行ASTREE 型电子舌预平衡的标定，在20 ℃环境下进行。经过处理后的试样盛放入专属烧杯中，试样容量为80 mL，对每一种试样进行6 次测量，每次进行测量的时间为传感器进入盛装试样的烧杯之后120 s，搅拌速率一般为1 r/s。用蒸馏水循环测试共4 次，每个洗涤时间均为30 s。以最后4 次循环记录的各味值平均值作为各滋味响应值。

2.2.2 供试品溶液的制备 通过干膏总量及配方颗粒中干膏-辅料1∶1 进行计算，根据每克枇杷叶配方颗粒的枇杷叶饮片生药量＝1/2/干膏总量×饮片投入量，每克蜜枇杷叶配方颗粒的枇杷叶饮片生药量＝1/2/干膏总量×饮片投入量×5/6，计算出不同配方颗粒所含生药量（指枇杷叶饮片），结果见表2。分别取相应量的对应配方颗粒粉末（过三号筛）适量，精密加入80 mL 怡宝蒸馏水，超声提30 min（功率100 W、频率40 kHz），定容至100 mL，超声5 min（功率100 W、频率40 kHz）使均匀，3 000 r/min离心（离心半径为4 cm）5 min 后，滤过，取续滤液，即得（供试品溶液所含枇杷叶饮片生药量为0.02 g/mL，相同质量枇杷叶饮片与蜜枇杷叶饮片中枇杷叶饮片质量比例为6∶5）。

表2 枇杷叶饮片生药量计算结果及取样量Table 2 Calculation results and sampling amount of raw materials of Eriobotryae Folium decoction pieces

2.2.3 样品质量浓度考察 用于电子舌测定的样品，其质量浓度应较稀，样品应澄清。将样品配制成质量浓度分别为1、5、10、20、30 mg/mL，进样测定，并实时观察在线谱图，结果表明当质量浓度20 mg/mL 时，在滋味响应值区域内并没有变异，据此，将20 mg/mL 作为该实验供试的样品质量浓度。

2.2.4 检验结果 分取EF-FG 和HEF-FG 各10 批进行测定，各味道［酸味（AHS）、咸味（CTS）、鲜味（NMS）、通用（CPS）、甜味（ANS）、苦味（SCS）］响应值的平均值见表3。

表3 EF-FG 及HEF-FG 各味道响应值 (n = 4)Table 3 Each taste response value of EF-FG and HEF-FG (n = 4)

2.3 EF-FG 与HEF-FG 各味道响应值配对的t 检验

使用SPSS 26 软件，通过对表2 中生制品与炮制品的各口味响应值数据进行配对样本t检验，结果见表4，其中AHS、CPS、SCS 的双侧P值差均低于0.05，表明枇杷叶蜜炙前后所制成配方颗粒中的上述3 种口味响应值具有统计意义，即枇杷叶蜜炙对上述3 种口味的影响程度较大。

表4 EF-FG 及HEF-FG 各味道响应值配对t 检验结果Table 4 Paired t test results of each taste response value of EF-FG and HEF-FG

2.4 EF-FG 与HEF-FG 的鉴别

2.4.1 配方颗粒特征滋味指纹图谱的建立 以各味值为坐标轴，再根据各味觉响应值自动变换的值，获得EF-FG 和HEF-FG 的滋味指纹图，结果见图1。HEF-FG 的AHS、CPS、SCS 味值区域具有明显差异，与EF-FG 区别显著。

图1 EF-FG 与HEF-FG 特征滋味指纹图Fig.1 Characteristic taste fingerprint of EF-FG and HEFFG

2.4.2 电子舌结果主成分分析（principal component analysis，PCA） 使用SIMCA 14 软件，对EF-FG和HEF-FG 2 组样本进行PCA，结果见图2。结果表明2 组样本处于2 个不同方位，并存在着明显组内差别，第1 主成分和第2 主成分的变异数贡献率均为96.90%（＞70%），因此，EF-FG 和HEF-FG 可以利用电子舌进行区分。

图2 EF-FG 与HEF-FG 滋味PCA 得分3D 图Fig.2 PCA score 3D diagram of EF-FG and HEF-FG taste

2.4.3 电子舌结果正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA） 使用SIMCA 14 软件，将EF-FG 与HEF-FG 2 个样本的各味道响应值进行OPLS-DA 模拟，结果见图3。从图3 中可发现，EF-FG 和HEFFG 被判在2 个不同位置，鉴别意义非常明显。该模型对X矩阵的解释率（RX2）＝0.978，对Y矩阵的解释率（RY2）＝0.852，该模型的预言能力（Q2）＝0.788，表明了该模型拟合度高、预测性较好（图4）。

图3 EF-FG 和HEF-FG 的OPLS-DA 得分图Fig.3 OPLS-DA score plot of HEF-FG and HEF-FG

图4 OPLS-DA 的模型验证图Fig.4 Model validation diagram of OPLS-DA

以变量重要性投影（variable importance projection，VIP）＞1 为筛选标准，与配对样本t检验结合筛选标志差异物，共筛选出2 个差异标志物（图5），分别是AHS、SCS，本实验研究条件下，OPLS-DA 技术能够对EF-FG 与HEF-FG 电子舌数据的结果进行有效判别。

图5 OPLS-DA 置换VIP 图Fig.5 Replacement VIP diagram of OPLS-DA

结合实验数据结果得出，EF-FG 酸味阈值为2 947.21～3 602.15，苦味阈值为3 403.63～4 159.99；HEF-FG 酸味阈值为2 480.49～2 947.21，苦味阈值为3 137.02～3 403.63。经3 批验证，EF-FG 与HEFFG 酸味、苦味味值位于相应区间，该方法能对EFFG 及HEF-FG 进行有效鉴别。

3 讨论

本研究从“炮制痕迹”及滋味评价出发，采用电子舌技术对EF-FG 及HEF-FG 滋味进行定量表征。药材在炮制过程中及中药配方颗粒的制备过程中，由于受热等因素的影响，药材与辅料相互作用，配方颗粒的味值与所用辅料的味值不一定完全相关，本研究表明，蜜炙可显著降低EF-FG 的酸味值，未增加其甜味值。各味值变化的原因可能与各味道相关的内在成分因炒制发生变化有关，样品中各味值与样品所含化学成分的相关性有待进一步研究。

PCA、OPLS-DA 技术可以实现EF-FG 与HEFFG 的快速识别，2 种识别模型可以相互验证。结合数据结果划分EF-FG 及HEF-FG 酸味、苦味阈值区间，3 批验证结果位于相应区间内。因此，电子舌技术可以从数值上客观化体现蜜炙对枇杷叶各味道的影响，可以对EF-FG 与HEF-FG 进行有效鉴别。

四气五味是中药药性理论的重要内容，研究表明，中药的味道与中药质量及其真假伪劣密切相关，是中药的一种自身的信息体现[15-16]。但对于建立以传统感官评价通过人体自身器官体验，依靠人体所观、所感不断的总结而推理出中药性能，把中药所拥有的自然属性与其内在有效成分所代表的内在属性关联到一起[17]，从而建立人体与自然的属性联接，但由于药物成分不确定性，传统感官评价对人体有一定的危害，且传统感官技术个人主观性较强，难以对中药及中药配方颗粒作出客观评价运用电子舌等感官技术可规避这些风险，为目前中药配方颗粒质量控制与标准研究多为指纹图谱、特征图谱及物质基础研究而面临耗时长及标准品浪费等一系列问题[18-21]及中药配方颗粒质量标准完善提供参考。

中药配方颗粒是中药饮片经提取、浓缩、干燥等处理制成的颗粒剂，制备完成后保留中药饮片药效，其性状却发生改变，利用人体感观无法对中药配方颗粒进行是否炮制进行判断。在国家药品监督管理局颁布的《中药配方颗粒质量标准公示》中，枇杷叶颗粒与HEF-FG 鉴别标准完全一致，不良厂家可能会利用这点进行偷工减料，两者药效存在一定差异，混淆使用可能无法达到治疗目的，延误病情，造成更加恶劣的结果。由于无法确认市场销售HEF-FG 原料是否经过炮制，为了保证实验结果的准确性，本研究自制10 批样品进行研究，后续还将应用建立的方法对市场上的成品进行对比研究。

本研究运用电子舌等智能感官技术对中药配方颗粒“炮制痕迹”进行研究，以一种安全有效便携的方式对炮制前后配方颗粒进行辨别，为中药配方颗粒是否经过炮制无法检识得问题提供解决参考。由于其检测阈值浓度较低，往往低于人体真实味觉阈值，可能对测定结果有一定的影响。结合参考文献及电子舌检测技术现状[22-24]，本研究对其测定方法进行了研究，但其完整性的方法学考察，目前尚未见报道，有待进一步研究。针对中药多靶标成分发挥效果的特点[25-27]，在后续研究还可对电子舌技术等感官技术结合网络药理学有效成分筛选方法及近红外检测等快检技术进行探讨，以期为中药配方颗粒“炮制痕迹”研究提供思路。

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