巨噬细胞向肌成纤维细胞转化促进LPS诱导的急性肺损伤模型小鼠肺纤维化

赵 东，查世乾，王易轩，潘 舟，于文蓁，胡 克

武汉大学人民医院 呼吸与危重症医学科二科，湖北 武汉 430060

下呼吸道感染是全球主要疾病负担,当以成纤维细胞增殖和细胞外基质过度沉积为主要表现的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)后肺纤维化的出现,预示着死亡风险升高[1-2]。尤其是当下新型冠状病毒感染背景下,国内外专家呼吁应加强该伴发疾病的救治措施[3-5],但鉴于其引起肺纤维化的临床治疗和转归相关资料极为有限,因此仍需要更多的临床观察和基础研究。

目前发现巨噬细胞向肌成纤维细胞转化(macrophage-to-myofibroblast transition,MMT)过程,在心肌、肾组织等脏器纤维化病变中表现出促进作用[6-9]。然而该转化机制在肺纤维化中发挥的作用尚不明确。本研究将借助脂多糖(lipopolysac-charide,LPS)诱导早期肺纤维化小鼠模型模拟肺部感染致ALI后肺纤维化的病理过程,探讨MMT在LPS诱导小鼠肺纤维化过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物:SPF级8～10周、体质量为20～25 g之间的C57BL/6J雄性小鼠[湖北省疾病预防控制中心,SYXK(鄂)2015-0027]。

1.1.2 主要试剂:脂多糖(LPS)(Sigma-Aldrich公司);达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)、胎牛血清(Gibco公司);Masson染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);α-SMA抗体、fibronectin(FN)抗体、collagen Ⅰ(Col1) 抗体、β-actin鼠源单克隆抗体、Smad3、p-Smad3抗体(Abcam公司);免疫组化二抗试剂盒(赛默飞世尔科技有限公司);RT-qPCR反转录试剂盒(TaKaRa公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠的分组与处理:共21只实验小鼠,随机分为7组,分别为对照(Ctrl)组、LPS诱导肺损伤早期纤维化(lipopolysaccharide-induced pulmonary fibrosis, LPS-PF)模型第3、7、10天组(day 3、day 7、day 10)和氯磷酸二钠脂质体(clodronate-liposomes,CL-LIP)干预模型第3、7、10天组(day 3、day 7、day 10),每组3只。

建立LPS-PF小鼠模型:参照文献[10]造模方法,经气管插管注入剂量为1.5 mg/kg的LPS 0.05 mL;然后在操作后48 h腹腔注入剂量为3.0 mg/kg的LPS 0.1 mL;最后在首次操作第5天气管内注入剂量为3.0 mg/kg的LPS 0.05 mL。对照(Ctrl)组小鼠干预时间点注射同体积0.9%氯化钠溶液。造模完成后1周进行组织取材。

CL-LIP干预组处理:小鼠在建立LPS-PF模型前第5天、24 h分别予以0.2 mL(5 mg/mL)CL-LIP静脉注入达到耗竭巨噬细胞的目的;之后隔3 d静注1次,直至造模完成。

1.2.2 小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage cells,BMDMs)的分离培养及体外诱导:小鼠麻醉后处死,在无菌环境下取出双侧股骨、胫骨,收集骨髓腔内容物经重悬、离心等步骤后,在含10 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子培养液中培养。每隔3 d换1次培养液,培养贴壁细胞即为巨噬细胞,此时的细胞可用于接下来的实验。体外细胞实验分为对照(Ctrl)组和体外诱导BMDMs向肌成纤维细胞转化组(TGF-β1刺激组)。

体外诱导BMDMs向肌成纤维细胞转化(MMT过程):在BMDMs细胞培养液中加入10 ng/mL的TGF-β1刺激诱导,5 d后使用免疫荧光共标检测,共标记有CD68和α-SMA的为MMT表型细胞[6-9, 11]。

1.2.3 肺组织纤维化评分:3位研究者采用盲法对Masson染色后的肺组织标本进行Ashcroft评分并取均值进行分析。评分分为0～8分,0分指正常肺组织,8分指肺组织形态结构完全被纤维组织取代。

1.2.4 其他指标检测:免疫荧光标记法检测组织、细胞样本中CD68、α-SMA标记物的表达量;Western blot检测肺组织和细胞样本中Smad3蛋白、p-Smad3、α-SMA蛋白的表达量;RT-qPCR检测α-SMA、FN(fibronetin)、Col1(collagen-1)的表达,α-SMA引物:上游CATGGCATCATCACCAACTG,下游GCTGGGACATTGAAAGTCTC;FN引物:上游GGACACTATGCGGGTCACTT,下游TCAAAACCAG TTGGGGAGTC;Col1引物:上游GCACCGTCAAGG CTGAGAAC,下游TGGTGAAGACGCCAGTGGA。反应条件:95 ℃ 30s预变性,95 ℃ 5 s变性60 ℃ 30 s退火延伸,40个循环;采用相对表达量计算法2-ΔΔCt计算目的基因相对表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 耗竭巨噬细胞可以减轻LPS诱导模型小鼠肺损伤后纤维化程度

与对照组相比,LPS和CL-LIP干预组第7天的HE染色可见肺泡结构被不同程度破坏甚至实变,肺间质内大量炎性细胞浸润以及间隔增厚;Masson染色也观察到淡蓝色胶原纤维染色明显增强(图1A)。LPS模型组第7天和第10天肺组织的Ashcroft评分(分别为6.27±0.51、6.73±0.82)较对照组(0.33±0.09)明显增加(P<0.01);而在CL-LIP组中,第7天评分(4.71±0.53)较对应时间点LPS组的评分显著降低(P<0.05)(图1B)。

A.pathological changes in each group by HE and Masson staining; B.Ashcroft′s score at different time points; Ctrl.control group; LPS-PF.lipopolysaccharide - induced pulmonary fibrosis group; CL-LIP.clodronate liposomes group; *P<0.01 compared with LPS-PF/CL-LIP and Ctrl group; #P<0.05 compared with LPS-PF and CL-LIP group in day 7.

2.2 耗竭巨噬细胞抑制LPS-PF模型小鼠中MMT过程

在LPS组, CD68α-SMA共标记的MMT表型细胞数量在第7天(292.0±61.9)和第10天(346.0±43.9)均较第3天(52.5±11.8)明显增加(P<0.01)(图2A, B)。而在CL-LIP组中,尽管α-SMA阳性细胞数较第7天LPS组的数量未见明显变化;但CD68和CD68 α-SMA共表达的阳性细胞计数均较LPS组显著降低(P<0.01)(图2A, B)。

A.expression of CD68, α-SMA, CD68 α-SMA in each group measured by immunofluorescent staining; B.number of CD68、α-SMA、CD68 α-SMA positive cells at different time points; Ctrl.control group; LPS-PF.lipopolysaccharide-induced pulmonary fibrosis group; CL-LIP.clodronate liposomes group; *P<0.01 compared with LPS-PF in day 7, 10 and in day 3; #P<0.01 compared with LPS-PF and CL-LIP group in day 7.

2.3 体外诱导MMT过程具有促纤维化作用

TGF-β1分别刺激24 h、48 h及96 h均可见CD68、α-SMA共标记现象,并且随着刺激时间的延长,共标记荧光强度逐渐增强(图3A)。第96 h的α-SMA蛋白表达量(0.93±0.03)较对照组(0.50±0.02)明显升高(P<0.05)(图3C)。RT-qPCR检测96 h的α-SMA(4.32±0.88比1.15±0.07)、FN(4.17±0.24比1.13±0.12)、Col1(3.76±0.68比1.16±0.16)表达水平较对应时间点明显上升(P<0.01)(图3D,E,F)。在刺激后第48 h,FN、Col1表达水平分别为2.98±0.29、1.98±0.26较对应时间点对照组的表达水平(分别为1.17±0.11、1.08±0.14)明显升高(P<0.05)(图3E,F)。

A.different expression of α-SMA (red light), CD68 (green light) in each group measured by immunofluorescent staining; B.Western blot detection of α-SMA protein expression; C.quantitation of α-SMA levels; E.RT-qPCR was used to detect the expression of α-SMA; F.RT-qPCR was used to detect the expression of FN; G.RT-qPCR was used to detect the expression of Col1; Ctrl.control group; MMT.macrophage-to-myofibroblast transition group; FN.fibronetin; Col1.collagen-1; *P<0.05, **P<0.01 compared with the Ctrl of 48 hours, 96 hours and 24 hours.

2.4 在MMT过程中Smad3、p-Smad3的表达量升高

体外诱导MMT过程中,Smad3的表达量在48 h(0.52±0.20)和96 h (0.87±0.13)较对应时间点的对照组(0.20±0.06、0.22±0.15)的明显增加(P<0.01)(图4A,B);磷酸化Smad3(p-Smad3)的表达量在48 h(0.49±0.21)和96 h(0.99± 0.18)较对应时间点的对照组(0.14±0.04、0.15±0.32)的明显增加(P<0.01)(图4A,C)。在LPS-PF模型组中,Smad3的表达量在第7天(1.10±0.56)和第10天(1.37±0.34)较对应时间点的对照组(0.49±0.08、0.45±0.05)的明显增加(P<0.01)(图4D,E);p-Smad3的表达量在第7天(0.67±0.06)和第10天(0.92±0.12)较对应时间点的对照组(0.34±0.06、0.39±0.07)的明显增加(P<0.01)(图4D,F)。

A.protein expression of Smad3, p-Smad3 in BMDMs; B, C.relative expression of Smad3, p-Smad3 protein in BMDMs; D.protein expression of Smad3, p-Smad3 in lung tissue; B, C.relative expression of Smad3, p-Smad3 protein in lung tissue; *P<0.01 compared with TGF-β1, LPS-PF group and Ctrl group.

3 讨论

LPS作为细菌细胞外壁主要成分,在诱导炎性反应中起到决定性作用,故常被用于ALI/ARDS动物模型的建立。本研究参考前人造模方法[10],观察到第7天肺组织胶原纤维含量明显增加;而耗竭体内巨噬细胞后,第7天肺纤维化的程度明显减轻,表明巨噬细胞在肺纤维化过程中发挥促进作用。

一般认为巨噬细胞对肺纤维化的影响主要与巨噬细胞极化有关,即对肺泡上皮细胞反复损伤与异常修复的过程[2,4,13]。一方面,M1型极化释放TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞因子加重肺部炎性反应;另一方面,M2型极化释放TGF-β1和IL-10等多种细胞因子,促进成肌成纤维细胞生成、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积,最终导致肺纤维化的发生发展。但巨噬细胞对肺纤维化促进的其他机制很少有报道。

肌成纤维细胞聚集被认为是肺纤维化的一个标志[11-12],主要包括驻留于组织中成纤维细胞、上皮细胞向间充质细胞转化以及骨髓组织衍生的循环纤维细胞激活三种来源。MMT过程的发现为研究巨噬细胞促进纤维化的可能机制提供了新方向,也为多种途径干预肌成纤维细胞提供依据。有研究将巨模型肺组织中观察到CD68α-SMA共表达细胞;在CL-LIP组中,由于巨噬细胞被提前耗竭,CD68 α-SMA共表达细胞数量明显降低。而体外实验诱导CD68α-SMA共表达的细胞表现促纤维化特性。从而表明在LPS-PF小鼠模型中,巨噬细胞对纤维化的促进可能是通过巨噬细胞向肌成纤维细胞转化过程完成。

Smad3与肺间质纤维化关系密切,已成为抗纤维化治疗的潜在靶点[12-13]。本研究在纤维化肺组织中检测Smad3和p-Smad3蛋白的表达水平明显升高也说明存在这种关系。而在进一步检测体外诱导CD68α-SMA共表达细胞Smad3和p-Smad3蛋白的表达发现,显著升高的Smad3和p-Smad3蛋白可能在MMT过程促纤维化进程中发挥重要作用。

综上,MMT过程在肺损伤肺组织中具有促纤维化作用。但本研究初次涉足MMT过程对LPS所致ALI模型小鼠肺纤维化的影响,尚需深入研究来了解MMT过程的具体机制,从而为改善ALI后肺纤维化提供更完整的理论依据。