桃叶珊瑚苷抑制人肝癌细胞系HepG2增殖

安 琪，齐光照，韩 超

郑州大学第一附属医院 药学部，河南 郑州 450000

肝癌(liver cancer)是世界上第七大常见癌,也是第二大癌死亡原因[1]。肝癌细胞增殖迅速、易转移,且有能力逃避免疫系统形成多重耐药性,通常导致患者预后不良,因此寻找新型治疗方法是改善当前问题的关键[2]。桃叶珊瑚苷(aucubin,AU)是一种广泛存在于杜仲、桃叶等中药材的活性物质,研究发现,AU能够抑制异种移植肝细胞癌模型小鼠体内的肿瘤生长,同时增强了顺铂在模型小鼠中的抗肿瘤功效[3]。癌基因MDM2蛋白Ser183位点的蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)磷酸化可抑制抑癌基因TP53介导的衰老并促进活性氧(reactive oxygen species, ROS)诱导的肿瘤发生[4]。AU能否通过调节Akt/MDM2/p53信号通路影响肝癌的进展尚不清楚。因此,本研究将探究AU对肝癌细胞及细胞周期的影响,进而为临床靶向治疗肝癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系、裸鼠:人肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721(武汉尚恩生物技术有限公司);BALB/c裸鼠(赛业生物科技有限公司)。

1.1.2 主要试剂:桃叶珊瑚花(aucubin,AU)(纯度≥98%,成都瑞芬思德丹生物科技有限公司);Akt激动剂(SC79,上海泽叶生物科技有限公司);CCK-8法细胞增值检测试剂盒[吉满生物科技(上海)有限公司];细胞凋亡检测试剂盒、p-Akt抗体、Ak抗体、p-MDM2抗体、MDM2抗体、p-p53抗体和p53抗体(Abcam公司);5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EDU)细胞增殖检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 筛选AU的给药浓度及细胞的分组:复苏HepG2细胞,无菌培养,取对数增殖期细胞进行后续实验。将HepG2细胞接种于96孔板培养24 h;用Tris缓冲液配制浓度为0、0.1、0.5、2.5、12.5和62.5 mg/L的AU溶液,分别加入HepG2细胞中培养48 h;每孔细胞加入10 μL CCK-8工作液孵育1 h,轻微震荡使细胞均匀分布,使用酶标仪检测HepG2细胞的存活率。随后将HepG2细胞分为4组:对照组(DMEM培养基培养)、AU低浓度组(AU L组,加入12.5 mg/L的AU溶液)、AU高浓度组(AU H组,加入62.5 mg/L的AU溶液)和AU H+SC79组(加入62.5 mg/L的AU溶液和1.8 mg/L的SC79)[5],置于无菌培养箱中培养48 h。

1.2.2 显微镜观察细胞增殖状态:使用倒置显微镜观察各组HepG2细胞增殖状态。

1.2.3 EDU法检测细胞增殖:在各组HepG2细胞中加入50 μmol/L/孔EDU培养基,置于细胞培养箱中孵育2 h,清洗;室温下使用多聚甲醛固定细胞10 min;加入2 mg/mL的甘氨酸孵育5 min,清洗;加入含0.5% TritonX-100的PBS溶液,摇床上孵育10 min,清洗;最后使用DAPI染液避光染色,显微镜下拍照并统计EDU阳性染色细胞比例。

1.2.4 流式细胞测量术检测细胞凋亡:在各组细胞中加入胰蛋白酶,配制1×109个/L浓度的细胞悬液,向Falcon试管中加入100 μL细胞悬液,再加入annexin V-FTTC和PI工作液各5 μL,避光静置15 min,加入结合缓冲液孵育1 h,使用流式细胞测量术检测细胞凋亡情况。

1.2.5 细胞周期的检测:使用PBS清洗细胞3次,更换培养基培养48 h,离心,弃上清,剩余细胞加入PBS重悬,根据细胞周期检测试剂盒要求,使用流式细胞术检测细胞周期分布情况。

1.2.6 Western blot检测p-Akt、Akt、p-MDM2、MDM2、p-p53、p53蛋白表达水平:提取各组细胞总蛋白质,定量后使用Western blot检测蛋白质的表达。样品上样量10 μg,电泳参数:80 V,30 min,转为120 V,1 h,转膜参数:200 V,2 h。将封闭后的PVDF膜分别置于p-Akt、Akt、p-MDM2、MDM2、p-p53、p53和GAPDH一抗稀释液中过夜,次日加入二抗稀释液和ECL发光液,分析各蛋白的表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度AU对HepG2细胞存活率的影响

随着AU浓度的增加,HepG2细胞的存活率递减,与0 mg/L AU组比较,12.5、62.5 mg/L AU组细胞的存活率显著降低(P<0.05),后续选择使用12.5、62.5 mg/L浓度的AU干预HepG2细胞(图1)。

*P<0.05 compared with 0 mg/L.

2.2 各组HepG2细胞增殖状态比较

对照组细胞单层贴壁增殖,密集成片,折光性好,大小均一;与对照组比较,AU L、H组悬浮细胞和脱落细胞逐渐增多,细胞皱缩变圆,丝状伪足减少;与AU H组比较,AU H+SC79组细胞数量和丝状伪足增加,脱落细胞减少,细胞皱缩情况显著改善(图2)。

图2 各组HepG2细胞增殖状态比较

2.3 各组HepG2细胞增殖比较

与对照组比较,AU L、H组EDU阳性染色细胞比例降低(P<0.05); 与AU H组比较, AU H+SC79组EDU阳性染色细胞比例升高(P<0.05)(图3)。

A.EDU staining (×200); B.comparison of stained cell proportions (n=6, %);*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with AU H.

2.4 各组HepG2细胞凋亡率比较

与对照组比较,AU L、H组G0/G1期细胞降低,细胞凋亡率、S和G2/M期细胞升高(P<0.05);与AU H组比较,AU H+SC79组G0/G1期细胞升高,细胞凋亡率、S和G2/M期细胞降低(P<0.05)(图4)。

2.5 各组HepG2细胞蛋白表达水平比较

与对照组比较,AU L、H组p-Akt/Akt、p-MDM2/MDM2蛋白表达水平下降,p-p53/p53蛋白表达水平升高(P<0.05);与AU H组比较,AU H+SC79组上述变化得到逆转(P<0.05)(图5)。

3 讨论

肝癌是最具社会挑战性的全球健康问题之一,其恶性程度高、进展快,治疗后易复发,靶向抑制癌细胞活力是临床上亟需突破的一大瓶颈[6]。AU是一种环烯醚萜苷,具有抗氧化、 抗炎、 抗癌等生物学作用[7]。本研究采用低、高两种浓度的AU体外培养肝癌HepG2细胞,均发现细胞数量变少,细胞悬浮、脱落,说明AU不利于HepG2细胞的增殖。进一步检测发现,AU能够抑制HepG2细胞的增殖能力,促进凋亡,抑制肝癌移植瘤小鼠瘤组织的生长,说明AU具有抗肝癌的作用。

细胞周期是由生长因子启动的信号通路,调控DNA复制、基因转录、蛋白质翻译、翻译后修饰等细胞事件的发生。真核生物的细胞周期由G0、G1、S2和M期组成。有研究证实,慢性肝病中肝细胞固有细胞周期相关激酶的异常激活通过免疫抑制重编程会破坏机体抗转移免疫监视系统,会对癌的转移产生影响[8]。在肝癌模型小鼠中,通过抑制细胞周期可以诱导抗肿瘤免疫反应,有效抑制肿瘤进展[9]。本研究发现,AU可以阻滞HepG2细胞周期,通过阻止G1停滞抑制癌细胞转移,提示这可能是其引起细胞凋亡的一个因素。

Akt主要在代谢器官中表达,响应细胞应激、运动以及各种激素和药物的刺激[10]。Akt激酶将细胞外信息转递到各细胞区室中,执行传导细胞迁移、衰老、凋亡等使命,识别上下游因子在癌中发挥传感器的作用[11]。Akt已经成为传统癌治疗、实体瘤免疫治疗和分子靶向治疗的主要预测标志物[12]。MDM2是一种公认的具有致癌潜力的分子,其多种促癌作用已被证实[13]。p53是一种肿瘤抑制因子,能够激活MDM2,而MDM2诱导p53降解,二者形成一个负反馈环。当p53活性受到抑制时,受损细胞便不再发生细胞周期停滞或凋亡。通过直接结合MDM2或磷酸化修饰p53可以抑制癌细胞增殖,改善癌治疗[14]。靶向调控Akt/MDM2/p53轴通过抑制细胞增殖和恶性侵袭以及促进细胞凋亡可以抑制肝癌的进展[15]。本研究发现,AU干预HepG2细胞后,p-Akt/Akt、p-MDM2/MDM2水平下降,p-p53/p53水平升高,提示AU可能通过调控Akt/MDM2/p53轴激活抑癌基因p53的表达,抑制HepG2细胞增殖。为了验证这一推断,本研究联合使用Akt激活剂SC79与AU共同干预HepG2细胞,发现细胞增殖、凋亡、细胞周期以及Akt/MDM2/p53信号的表达没有显著变化,证实AU是通过调控Akt/MDM2/p53信号通路发挥对肝癌细胞生理活动的调节作用。

综上所述,AU可能通过调控Akt/MDM2/p53信号通路抑制肝癌细胞增殖,诱导细胞周期阻滞与细胞凋亡。