醋酸发酵阶段添加不同类型高温大曲对食醋风味品质的影响

马嘉艺,黄浩伦,刘孟春,熊羊城,张晓娟,柴丽娟,陆震鸣*,许正宏

1(江南大学 生物工程学院,江苏 无锡,214122)2(江南大学 粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心, 江苏 无锡,214122)3(贵州省仁怀市茅家村酱醋有限公司,贵州 遵义,564500)

我国有着悠久的酿醋历史。按照醋酸发酵方式的不同,可以将食醋分为固态发酵食醋、液态发酵食醋和固液复合发酵食醋[1]。我国的传统食醋是以各种粮食谷物为主要原料,以麸皮、糠壳等为辅料,通过固态发酵工艺酿造而成,如山西老陈醋、镇江香醋、四川麸醋等[2]。不同原料、不同发酵工艺都会对食醋的风味产生影响,风味是影响食醋感官质量的重要因素。非挥发性和挥发性化合物是固态发酵食醋中两大类主要的风味物质,非挥发性化合物主要包含有机酸、氨基酸和糖类等,挥发性化合物包含酸、醇、酯、酮、醛类等,是食醋香味和滋味的主要来源[3]。

醋酸发酵是食醋酿造中的重要环节,是食醋风味形成的关键阶段。典型的固态发酵工艺酿造的食醋,通常会接入部分发酵成熟的醋醅,或经自然接种,作为醋酸发酵阶段的起始,多种微生物在发酵过程中富集和演替,醋酸菌将乙醇转化为乙酸,同时乳酸菌、芽孢杆菌等多种微生物也能够发酵形成种类丰富的风味物质[4-5]。

传统固态发酵食醋的酿造多以大曲、药曲等作为糖化发酵剂[6],其中,大曲的主要功能为:投粮、糖化、发酵和增香。按制曲的最高品温,可以将大曲分成低温、中温和高温大曲3类。高温大曲的制曲最高品温达60 ℃以上,在食醋酿造中的应用研究较少,通常用于生产酱香型白酒[7]。酱香型白酒是中国三大传统白酒之一,具有浓郁持久的香气,其风格源于独特的酿造工艺和发酵特点[8],高温大曲为白酒的酿造提供了丰富的微生物、独特的酱香成分和前体物质,在赋予酱香型白酒典型特征香气和滋味方面起着关键作用[9]。同时,由于在发酵仓内所处位置不同,温度、水分、氧气浓度等存在差异,高温大曲又可分为3种不同类型:白曲、黄曲和黑曲,它们颜色不同,风味也各不相同[10-11]。

在醋酸发酵阶段添加不同类型的高温大曲进行食醋的酿造,将高温大曲中含有的香气成分及前体物质带入到成品醋中,发挥高温大曲的增香作用,可以丰富食醋的风味;此外,高温大曲可能给醋酸发酵过程提供少量的微生物和酶类,对提升食醋的风味品质也具有积极作用。本研究尝试将白曲、黄曲、黑曲3种不同类型的高温大曲拌入醋醅进行醋酸发酵,制备固态发酵食醋,以期达到改善食醋风味品质的目的,为食醋产品的开发和风味品质改良提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白曲、黄曲、黑曲3种高温大曲样品,由贵州仁怀某酒厂提供;麸皮、稻壳、及种醅,由江苏镇江某醋厂提供;糯米,产自辽宁沈阳;酿酒酵母,湖北安琪酵母有限公司。

NaCl、NaOH、ZnSO4、K4[Fe(CN)6](分析纯),国药集团化学试剂公司;2-辛醇(色谱纯),美国Sigma公司;甲醇、乙酸、乳酸、草酸、酒石酸、丙酮酸、柠檬酸、焦谷氨酸、琥珀酸(色谱纯),上海阿拉丁生化科技股份公司。

1.2 仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱仪,美国Waters公司;GC 7890B-MSD 5977B气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stableflex (gray) 固相微萃取头,美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 食醋制备工艺与样品采集

以糯米为原料,经浸泡、蒸煮、糖化和冷却后补水至料液比为1∶4(g∶mL),加入酿酒酵母(质量分数0.5‰)进行酒精发酵7 d,得到米酒酒醪。将米酒酒醪分别添加白曲WQ、黄曲YQ和黑曲BQ(质量分数5%),拌入麸皮和稻壳、接入种醅,进行醋酸发酵;同时,设置不添加高温大曲的对照组。醋酸发酵持续6 d,每天从醋缸的上、中、下层3个位置分别取样,等量混匀,得到醋醅样品,冻存于-20 ℃冰箱备用,用于后续分析。不添加高温大曲的对照组醋醅设置编号为CC,添加白曲的醋醅为CW,添加黄曲的醋醅为CY以及添加黑曲的醋醅为CB。

当醋醅酸度不再上升即醋酸发酵结束时,封醅7 d进行后熟,封醅结束后将醋醅混匀进行淋醋、过滤和煎醋,再混匀取样,分别得到对照组成品醋样品CCV、添加白曲的成品醋样品CWV、添加黄曲的成品醋样品CYV和添加黑曲的成品醋样品CBV。

1.3.2 总酸含量的测定

醋醅和成品醋样品依据GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》的酸碱指示剂滴定法进行测定。

1.3.3 有机酸含量的测定

醋醅和成品醋样品依据GB/T 18623—2011《地理标志产品 镇江香醋(含第1号、2号、3号修改单)》的高效液相色谱法进行测定。

1.3.4 挥发性化合物含量的测定

高温大曲样品依据文献[12]的方法,醋醅和成品醋样品依据文献[13]的方法。

将测得的质谱图与NIST谱库比对进行定性分析,采用内标峰面积归一化法计算各种成分的相对含量。

1.3.5 成品醋的感官评价

参考GB/T 18623—2011《地理标志产品 镇江香醋(含第1号、2号、3号修改单)》,由10名经过培训的专业人员组成感官评价小组,按照表1的评价标准(100分制)对所得的4种成品醋样品进行感官评价,以平均得分为最终结果。

表1 成品醋的感官评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of vinegar

1.3.6 数据处理与分析

使用Excel 2016对数据进行统计,使用SPSS 26对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)并用GraphPad Prism 8.0.2作图。采用SIMCA 14.1对挥发性化合物进行偏最小二乘判别分析(partial least squares-discrimination analysis,PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares-discrimination analysis,OPLS-DA)及相关图形绘制。

2 结果与分析

2.1 高温大曲对食醋总酸含量的影响

2.1.1 醋酸发酵过程的总酸含量变化

如图1所示,醋酸发酵起始时醋醅的总酸含量(以乙酸计)为0.6 g/100 g左右,随着醋酸发酵的进行,醋醅的总酸含量逐渐增多,最终达3.8 g/100 g左右。醋酸发酵第2天时,添加黑曲的醋醅总酸含量明显升高,且显著高于其他醋醅(P<0.05)。醋酸发酵至5～6 d时,由于营养物质的消耗和有机酸的积累,醋酸菌等产酸菌代谢缓慢,醋醅的总酸含量趋于稳定。发酵结束时,实验组醋醅的总酸含量均高于对照组醋醅,这是由于高温大曲具有投粮作用,其中含有的营养物质能够作为底物被微生物分解利用从而产酸[14]。

图1 醋酸发酵过程中总酸含量变化Fig.1 Changes of total acidity in acetic acid fermentation

2.1.2 成品醋的总酸含量

如表2所示,4种成品醋的总酸含量在6.33～6.55 g/100 mL(以乙酸计)。添加高温大曲后成品醋的总酸含量均得到提高,且添加白曲的成品醋CWV总酸含量最高,表明醋酸发酵阶段添加高温大曲有利于提高食醋的总酸含量,并且与黄曲和黑曲相比,白曲中含有更多未被利用的营养物质,白曲对食醋总酸含量的提升效果更好。

表2 成品醋的总酸含量 单位:g/100 mL

2.2 高温大曲对食醋有机酸含量的影响

2.2.1 醋酸发酵过程的有机酸含量变化

在醋酸发酵过程中,醋醅的总有机酸含量逐渐增多。如图2所示,醋醅的主体有机酸均为乙酸。乙酸具有刺激性强、回味短的特点,乳酸是食醋中重要的不挥发酸,主要是在厌氧条件下由乳酸菌转化糖分而生成,具有酸感柔和的特点[15]。醋酸发酵结束时,拌入高温大曲的3组醋醅的乳酸含量均高于对照组醋醅,且添加白曲的醋醅乳酸含量显著高于对照组醋醅(P<0.05),说明在醋酸发酵阶段添加高温大曲有利于乳酸的积累,且添加白曲的作用优于黄曲和黑曲。

图2 醋酸发酵过程中有机酸含量变化Fig.2 Changes of organic acids contents in acetic acid fermentation

2.2.2 成品醋的有机酸含量

有机酸作为食醋风味物质的主要成分,对食醋整体感官有着重要的影响。单纯的乙酸具有刺激性气味,乳酸、琥珀酸、柠檬酸等不挥发酸可调和食醋的酸味,减少醋酸对味觉的刺激,改善食醋的酸味质量[16]。如表3所示,4种成品醋的有机酸组成均以乙酸为主,添加高温大曲的3种成品醋的总有机酸含量增加,主要体现为乙酸和乳酸含量均高于对照组成品醋CCV,成品醋CWV中乙酸和乳酸含量显著高于对照组成品醋CCV,与醋醅的有机酸含量变化规律相符,说明在醋酸发酵阶段添加高温大曲有利于成品醋中乙酸和乳酸的积累,且添加白曲的作用更优。此外,成品醋CWV的柠檬酸含量也有少量提高,但在成品醋CYV和CBV中略有降低,其余种类的有机酸含量无显著变化。

表3 成品醋的有机酸含量 单位:g/L

2.3 高温大曲对食醋挥发性化合物的影响

2.3.1 高温大曲的挥发性化合物组成

如图3所示,通过顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)分析,在白曲、黄曲、黑曲3种高温大曲中共检出76种挥发性化合物,白曲、黄曲和黑曲分别检出63、67、67种挥发性化合物。醇类化合物是高温大曲样品中占比最高的挥发性化合物,其次是醛类和酸类化合物。不同样品中各类挥发性化合物的占比不同,白曲的醇类含量相对最高,黄曲具有相对较多的醛类和酯类化合物,黑曲的吡嗪类化合物含量相对最高。

a-挥发性化合物个数;b-挥发性化合物占比

采用PLS-DA模型对不同类型的高温大曲的挥发性化合物进行分析,图4中3种高温大曲样品能够进行较好的区分,说明3种不同类型的高温大曲之间的挥发性化合物具有明显差异。

图4 高温大曲挥发性化合物的PLS-DA得分图Fig.4 PLS-DA score plot of volatile compounds of high-temperature Daqu

2.3.2 成品醋的挥发性化合物组成及差异分析

采用HS-SPME-GC-MS测定成品醋样品的挥发性化合物,结果如图5所示,4种成品醋共鉴别出79种挥发性化合物,成品醋CWV、CYV和CBV的化合物个数均多于对照组成品醋CCV,说明在醋酸发酵阶段添加高温大曲能丰富食醋的挥发性风味。酸类化合物是成品醋样品中占比最高的挥发性化合物,其次是酯类和醇类,醛类、酚类、酮类等占比较低。不同成品醋样品中各类挥发性化合物的个数和占比存在一定差异,对照组成品醋CCV的酸类化合物占比最高,达63.27%,添加黑曲的成品醋CBV的酸类化合物占比最低,但醇类和酯类化合物占比最高。

OPLS-DA是一种有监督的分析方法,通过预设分类,强化组间差异[17]。采用OPLS-DA分别对对照组成品醋CCV与实验组成品醋CWV、CYV和CBV的挥发性化合物进行分析。模型参数如表4所示,3组模型的R2X、R2Y和Q2均高于0.5,表明模型稳定,拟合度和预测能力较高,能较好地解释和预测成品醋整体挥发性化合物之间的差异。如图6所示,对照组成品醋CCV与实验组成品醋CWV、CYV和CBV均分布于坐标轴不同区域,得到较好分离,说明分别添加3种不同类型高温大曲的成品醋与对照组成品醋的挥发性化合物存在显著差异。根据OPLS-DA筛选出VIP>1.0且P<0.05的挥发性化合物共38种,包括醇类化合物6种、醛类化合物1种,酸类化合物6种、酯类化合物16种、酮类化合物4种、酚类化合物2种、呋喃类化合物1种及其他类化合物2种,这些挥发性化合物是区分成品醋样品的重要差异化合物,含量如表5所示。

表4 成品醋的OPLS-DA模型参数Table 4 OPLS-DA model parameters of vinegar

a-CCV-CWV;b-CCV-CYV;c-CCV-CBV

由表5可知,在成品醋的重要差异挥发性化合物中,对照组成品醋中未检出而添加高温大曲的成品醋中检测到的化合物有10种,包括:乙醇、己醇、2-庚醇、癸醛、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、1-辛烯-3-酮和萘。乙醇的存在可能是由于醋醅含有的乙醇未被完全利用而有部分残留或是添加的高温大曲中含有耐酸的酿酒酵母,能够在酸性条件下生长繁殖从而积累了少量乙醇;己醇是3种高温大曲本身含有的化合物,具有花香果,在成品醋CWV中未检出,但在成品醋CYV和CBV中含量显著提升,说明添加黄曲和黑曲有利于成品醋中己醇的积累;2-庚醇只在成品醋CBV中检出且含量较低,具有花果香。成品醋CYV和CBV中含有少量具有橙皮味的癸醛[18]。乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丁酯和乙酸异戊酯,具有菠萝香、水果香、花香和香蕉香等风味[19-20]。添加黄曲和黑曲的成品醋中含有少量具有蘑菇味的1-辛烯-3-酮,是高温大曲中本身含有的物质。此外,萘也是高温大曲引入成品醋中的化合物,3种高温大曲本身含有少量的萘,经过醋酸发酵阶段后,在添加黄曲和黑曲的成品醋CYV和CBV中积累较多。

表5 成品醋的重要差异挥发性化合物含量 单位:ng/L

添加高温大曲的成品醋相较于对照组成品醋,含量增加的重要差异挥发性化合物有:异戊醇、4-甲基-5-癸醇、β-乙基苯乙醇、己酸、顺-5-十二碳烯酸、辛酸、壬酸、丁二酸二乙酯、γ-己内酯、4-乙酰氧基丁酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、3-乙酰基-2-丁酮、2-甲氧基-4-基苯酚和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚。异戊醇是3种高温大曲本身含有的化合物,具有果香,略带酸味[19],在成品醋CWV中含量有所降低,但在成品醋CYV和CBV中含量显著提高,说明添加黄曲和黑曲有利于异戊醇的积累。辛酸是3种高温大曲本身含有的化合物,具有花果香和油脂臭[20]。丁二酸二乙酯、4-乙酰氧基丁酸乙酯、苯乙酸乙酯和乙酸苯乙酯等能赋予食醋水果香气和甜香。2-甲氧基-4-甲基苯酚具有辛香、烟熏味,2-甲氧基-4-乙烯基苯酚具有焙烤香、烟熏味[20-21]。

此外,也有部分重要差异化合物在对照组成品醋中含量更高,而在添加高温大曲的成品醋中含量较低,包括:异戊酸、2-甲基己酸、乳酸乙酯、乙酸庚酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、棕榈酸乙酯、3-羟基-2-丁酮、植酮、2-正戊基呋喃和十一烷。其中,异戊酸具有酸臭味,乳酸乙酯、癸酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯和棕榈酸乙酯具有水果香、葡萄香、淡奶油香、甜香和奶香等风味[19],3-羟基-2-丁酮具有奶油香气[21]。

总的来说,高温大曲赋予了成品醋更多具有花果香、烟熏味和甜香的重要差异挥发性化合物,并且添加黄曲和黑曲的成品醋与对照组成品醋的挥发性化合物在种类和含量上的差异更为明显。

2.4 成品醋的感官评价结果

如图7所示,所有成品醋的色泽和体态得分均在20分以上,添加白曲、黄曲和黑曲的成品醋的色泽与对照组成品醋相比依次加深;香味和滋味的得分有明显差异,添加高温大曲的成品醋香味更为醇厚、口感更为柔和协调。添加黄曲的成品醋CYV的得分最高,而对照组成品醋CCV的得分最低,表明在醋酸发酵阶段添加高温大曲能改善成品醋的风味品质,添加黄曲的效果最佳。

图7 成品醋的感官评价得分Fig.7 Sensory evaluation scores of vinegar end product

3 结论与讨论

本研究将白曲、黄曲、黑曲3种不同类型的高温大曲拌入醋醅中进行醋酸发酵,制备固态发酵食醋。结果表明,在醋酸发酵阶段添加3种不同类型的高温大曲均能够提高成品醋的总酸和有机酸含量,主要表现为乳酸和乙酸含量的提升,提升效果为白曲最佳;同时,HS-SPME-GC-MS显示3种不同类型高温大曲的添加均能丰富成品醋的挥发性风味,OPLS-DA筛选出38种具有重要差异的挥发性化合物,高温大曲赋予了成品醋更多具有花果香、烟熏味和甜香的重要差异挥发性化合物,并且添加黄曲和黑曲的成品醋的挥发性化合物与对照组成品醋的差异更为明显;此外,感官评价表明醋酸发酵阶段添加高温大曲能改善成品醋的风味品质,并且添加黄曲的效果最佳。本研究证实了在醋酸发酵阶段添加高温大曲能改善固态发酵食醋的风味品质,为食醋产品的开发和风味品质改良提供参考。由于高温大曲富含多种微生物和酶类,进一步的研究可以基于高通量测序技术,结合代谢组学、宏基因组学等,探究添加不同类型高温大曲的醋醅中微生物和相关代谢产物的变化情况,精确阐明高温大曲中的微生物和酶类对食醋风味品质的影响。