响应面结合模糊数学制备奶酪美拉德反应物的研究

高鹏，张文远，徐琛，赵晓璇，谢宁，王筠钠，逄晓阳，张书文，吕加平

（中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）

0 引 言

奶酪被誉为“奶黄金”，是牛奶或羊奶经凝乳发酵、排乳清浓缩、成熟等获得的高端营养食品[1]。奶酪富含蛋白质，是蛋白水解的优质原料。通常情况下，直接酶解蛋白质获得的蛋白水解液存在风味寡淡等缺陷，而在此基础上的美拉德增香反应可提高产品风味[2-3]。美拉德反应主要发生在氨基和羰基之间，且受反应工艺条件的影响[4-5]。在食品中，美拉德反应主要能用于功能性开发及食品增香，但此方面的研究主要集中在肉制品及植物基食品中[4,6-9]。在乳制品中对于美拉德反应的研究大多集中在不同热处理乳、婴幼儿配方奶粉等在热加工过程及储藏过程中的美拉德副产物的报道[10-12]，也有少数聚焦于褐色酸奶的制作及其风味特性研究[13]。目前，关于富含氨基化合物的奶酪酶解液在美拉德产香反应及改善颜色2 个方面的研究较少。其中，产物的褐变程度能集中体现美拉德反应进程，褐变度与美拉德反应程度呈正相关性，而风味评价主要包括感官评价、电子鼻、电子舌等模拟评价及风味成分检测。感官评价依靠人体主观味觉和嗅觉评价食品的风味品质，具有一定的主观性和不确定性，模糊数学方法能降低感官评价者的主观偏差，使结果更加科学准确[14]。因此，本文以奶酪凝乳调配物的蛋白水解产物为基础，结合D-木糖和D-葡萄糖设计单因素及响应面美拉德反应实验，确定最佳生产工艺，制备得到最佳产物并分析其风味特征，为工业上制备奶酪风味香料提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马苏里拉奶酪凝乳（水分48.0%、蛋白23.0%、脂肪26%、糖<0.5%），德国DM K 公司；乳化盐（磷酸氢二钠），北京萃锋科技有限公司；三聚磷酸钠，北京沃格东方科技有限公司；柠檬酸钠，北京依珊汇通科技有限公司；蛋白酶Protease 2SD (100 000 U/g)，上海天野酶制造有限公司；木糖、葡萄糖，北京萃锋科技有限公司。

1.2 仪器与设备

TS-25C 反式高温蒸煮锅，北京兰德梅克科技开发有限公司；SPARK 20M 酶标仪，TECAN；DJ5-2012R 欧偌智能摇床，上海世平实验设备有限公司；QP2010 Plus 气相色谱-质谱分析仪，日本岛津。

1.3 实验方法

1.3.1 奶酪酶解液的制备

按奶酪粒∶水∶乳化盐=56.7∶41∶2.3 制备奶酪浆，边加热边用组织分散机于80 ℃下剪切15 min，使奶酪粒乳化成均匀浆液，快速冷却到45 ℃后，加入0.4%（占奶酪粒重量比例）的蛋白酶Protease 2SD 于45 ℃、250 r/min 摇床酶解4 h，无pH 控制。然后，将样品置于90 ℃，20 min 灭酶，快速冷却到室温后用食用碱调节酶解液pH 至7.0，分别加入葡萄糖、木糖，搅拌并加热使其反应，反应结束后取出物料，快速冷却待分析。

1.3.2 美拉德反应条件单因素试验设计

1.3.2.1 反应工艺条件单因素优化选择

控制葡萄糖∶木糖=1∶2，物料初始pH 为7.0，采用控制变量法设计美拉德反应温度、反应时间及总糖添加量工艺条件，其中，总糖添加量范围在2%～10%（占物料的百分比），反应温度范围在80～120 ℃，反应时间范围在0～120 min。

1.3.2.2 单因素工艺优化评价指标

（1）荧光强度的测定。待测样品用实验室超纯水稀释100 倍，于347 nm 的激发波长和415 nm 的发射波长处测定样品荧光强度。

（2）褐变度的测定。褐变度常用于评估美拉德反应的剧烈程度，褐变度越大，反应越剧烈。褐变度的测定参考文献[15] 并略微改动。样品稀释200 倍后用酶标仪记载294 nm 和420 nm 波长处分别测定不同糖基化样品的吸光度。

（3）Friedm an 排序检验。感官评价由10 位（5 名女性，5 名男性，年龄分布在18～30 周岁）经验丰富的感官评价员进行评价，感官标准参考RHB301-2004。评分采用分值制（1～5 分，1 分最讨厌，5 分最喜欢），并通过多重比较分析结果差异度。

1.3.3 美拉德反应条件优化的响应面试验设计

试验设计如表1 所示，分别选取反应温度、时间及总还原糖添加量3 个因素的3 个水平，通过软件设计得到15 种实验组合，计算模糊数学感官得分，进而确定最优工艺。

表1 响应面试验设计因素与水平

1.3.4 感官评价模糊数学模型的建立

1.3.4.1 因素集和评语集的建立

因素集U={u1，u2，u3}={滋味与气味，组织状态，色泽};评语集V={v1，v2，v3，v4，v5}={很好，较好，中，较差，很差}，评分时，v1=4 分，v2=3 分，v3=2 分，v4=1 分，v5=0 分。感官评价标准如表2。

表2 感官评价标准

1.3.4.2 感官评价因素权重系数的确立

采用用户调查法结合RHB301-2004“全脂加糖炼乳感官质量评鉴细则”确定奶酪美拉德反应液评价过程中各因素所占权重。最终确定权重W={滋味与气味W1；组织状态W2；色泽W3}，其中W1=0.80；W2=0.15；W3=0.05。

1.3.4.3 感官评分的计算

奶酪酶解液的美拉德反应产物感官指标综合评判的结果用R表示，R=W×A，其中，W表示权重，A为模糊矩阵。固定赋值：很好，4 分；较好，3 分；中，2分；较差，1 分；很差，0 分。通过加和R的各个量与赋值的乘积，得到每个样品的感官评分。

1.3.5 肽段分子量及挥发性物质测定

测定方法均参考文献[16] 。肽段分子量的测定方法如下：取适量样品于9 000 r/min 离心10 min 去除脂肪，上清液加入等体积的10%的三氯乙酸沉淀去除蛋白，继续在6 000 r/min 离心5 min，吸取上清液通过0.22 μm 的水系滤膜后放于进样小瓶进样。采用配有W aters 2487 紫外检测器的超高效液相色谱分析奶酪酶解液及美拉德反应物的肽段分子量分布。色谱柱：2 000(300×7.8 mm)SW XL TSK(Tosoh Co.,Tokyo,Japan)。流动相为含0.1%三氟乙酸的55% (V/V)乙腈溶液，采用等梯度洗脱。样品以0.5 m L/min 的流速洗脱，在214 nm、40 ℃下检测。进样体积10 μL。采用上海源叶生物技术有限公司的4 种标准品:抑肽酶(6 ku)、杆菌肽(1.5 ku)、四肽GGTA(450 u)和二肽GS(150 u)。

本研究使用固相微萃取-气相色谱-质谱（SPM E-GC/M S）测定样品挥发性风味物质。顶空固相萃取条件：纤维头PDM S/DVB；平衡温度：50 ℃；震荡萃取时间：30 min；色谱柱DB-W AX (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度：250 ℃，载气为氦气，流速为1.0 m L/min。程序升温条件：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升温至200 ℃，保持5 min，继续以10 ℃/min 升温至230 ℃。质谱条件：电离方式为EI，电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃。采用全扫描方式，范围为35 ～350 m/z。

化合物采用2 种方法定性：通过与质谱文库(N IST 17-1、17-2 和17 s)比对，并用保留指数(R I)进行鉴定。一系列的正构烷烃（C 7-C 40）为外部参比，测定各化合物的R I。R I 计算公式为:R I = 100 n + 100(ti- tn)/ (tn+1 - tn)，其中ti、tn和tn+1 分别为化合物i、烷烃n 和烷烃n+1 (tn

1.4 数据处理

Friedm an 排序检验结果的多重比较及数据间方差分析均采用SPSS 23 软件完成，Duncan 法进行各组数据间差异性比较（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 总还原糖添加量对美拉德反应的影响

美拉德反应的中间产物具有荧光性，故通过测定反应体系的荧光强度可以反映奶酪酶解液的褐变反应程度。另外，美拉德反应中间产物和终产物的累积可以由反应体系在294 nm 和420 nm 波长处的吸光度反映[4]。糖添加量对反应褐变度影响结果显示如图1所示，样品荧光强度及吸光度受糖含量的影响，在一定糖含量范围内（2%～8%），荧光强度及吸光度（294 nm）逐渐增加，超出8%后，样品整体褐变度略有下降。值得注意的是，糖添加量的增加对美拉德反应终产物的累积影响不大。糖、醛及小分子酮等主要是美拉德反应中产生的无色中间产物，主要反映在294 nm 波长处，420 nm 处吸光度代表了美拉德反应产生的一些终端产物（如类黑精）。

图1 总糖添加量对美拉德反应产物褐变程度的影响

如表3 所示，统计量F=4.560 （SPSS）。对比Friedm an 秩和检验近似临界值表可得，P，J，a（5，10，0.01）的临界值为13.38 > F=4.560。由此可知不同糖量的添加对于产物感官评分影响在0.01 水平下不显著。但由于RC=39 最大，确定以6%还原糖添加量为中心点进行响应面实验设计。

表3 不同还原糖添加量下样品的秩和

2.1.2 反应时间对美拉德反应的影响

由图2 可知，在反应0～120 min 内，样品的荧光强度及294 nm 波长处的吸光度随着反应时间的延长而逐渐增加，这表明一些糖、醛等无色中间产物随着反应时间的延长而逐渐增加。

图2 反应时间对美拉德反应产物褐变程度的影响

如表4 所示，统计量F=14.000 > 13.38，表明各组样品存在显著性差异。RC=39 达到最高，RC=15 为最低（120 min），即在其它条件固定不变下，样品在反应60 min 后最理想，而反应时间过短或过长都不利于样品风味的发展。

表4 不同反应时间下样品的秩和

2.1.3 反应温度对美拉德反应的影响

从图3 可以看出，反应温度在90 ℃时属于美拉德反应拐点，在反应温度从90 ℃上升到100 ℃时，奶酪酶解液的褐变度急剧增加。超过100 ℃后，美拉德反应进程缓慢，甚至荧光性中间产物略有下降，这可能是由于某些荧光性物质转变成其它非荧光性物质。

图3 反应温度对美拉德反应产物褐变程度的影响

如表5 所示，F=17.840 > 13.38，差异性显著。C 样品整体风味协调，焦香味适中，具有类似萨姆奶茶及奶咖啡的味道。A 香气略偏向牛奶，而D 和E 的糊味较重，而RC=40 得分最高，由此可见，美拉德反应温度在100 ℃时较好。

表5 不同反应温度下样品的秩和

2.2 响应面试验结果及最佳工艺验证

根据响应面试验设计得到15 组试验方案，由10 名感官评定人员对试验方案样品的滋味和气味、组织状态、色泽进行感官评定选择，统计汇总后结果如表6 所示。

表6 奶酪美拉德反应产物的感官评定票数统计分布

将票数折算成赞成的比率，得到模糊矩阵Aj。如下所示：试验1 号的模糊矩阵为同理可得2 号～15 号。

依据模糊综合评判数学模型原理，采用矩阵乘法计算规避因大取小算法产生的误差。以试验1 号样品为例：R1=W×A1=（0.8，0.15，0.05）×(0.015，0.295，0.220，0.285，0.185)。

将综合评判结果的每个量分别乘以其对应的分值相加可得出样品的最后总得分，试验1 号总得分为0.015×4+0.295×3+0.220×2+0.285×1+0.185×0=1.67。同理可得2 号～15 号感官评分。综合评判结果如表7所示，模糊数学感官评分最高为R13=3.125。

表7 综合评判结果和感官评分

利用设计软件Design-Expert 对数据进行多元回归拟合，获得反应温度（A）、反应时间（B）、糖添加量（C）的二次多项回归方程为：R=-63.67375+1.18321A+0.113931B+1.11937C-0.000433AB-0.001625AC-0.000333BC-0.005667A2-0.000574B2-0.074792C2。对回归方程进行方差分析，结果如表8。

表8 回归模型方差分析及回归方程系数显著性检验

如表8 所示，回归模型P<0.001（极显著）；A、C在一次项中影响显著。通过对3 个因素的F值大小进行比较，结果表明3 个因素对美拉德反应液感官评分影响的主次顺序为酶解温度（A）>糖添加量（C）>酶解时间（B）；AB相互作用显著，R2=0.9859 说明回归方程拟合度好，该模型成立，可进行预测分析。根据所建立的数学模型进行参数最优化分析，得到最优反应条件为反应温度101 ℃，时间59 min，糖添加量6.25%。固定此条件不变，制备3 次平行试验，实际得到综合评分平均值为3.123 分，优于预测值。由此可见，响应面结合模糊数学感官评价对于优化奶酪蛋白水解物美拉德反应条件具有实用价值。

2.3 肽段分子质量分析

图4 展示了奶酪酶解液及美拉德反应过程中的肽段分子质量分布变化，分别是<150 u，150～450 u，450～1 500 u，1 500～3000 u，3 000～6 000 u 以及>6 000 u。从图中可以看出，奶酪美拉德反应液中<150 u 的肽段较奶酪酶解液显著降低，这说明<150 u 的小肽及游离氨基酸可能是发生美拉德反应的主要原料。而发生美拉德反应后，150～450 u 范围的肽段显著增加，这可能是加热过程中某些小肽发生交联作用的结果[17]。据报道，美拉德反应中分子质量较小的交联产物能提高最终产物的持续感和醇厚感[18-19]。

图4 奶酪酶解液及美拉德反应中肽段分子质量分布变化

2.4 挥发性风味物质分析

尽管美拉德反应程度可以通过反应液色泽及吸光度判断，但样品的关键香味成分仍有必要确定。对最优工艺条件下的奶酪肽样品及其美拉德反应产物进行GC-M S 定性分析，总共鉴定出30 种挥发性风味成分，包括酸、酮、醛及吡嗪等。图5 展示了对奶酪酶解肽液及其美拉德反应产物的挥发性物质分析结果。其中，图5a 经过列标准化处理及聚类分析，以便比较每一列中同一种化合物在奶酪肽及其美拉德反应产物中的含量差异，图5b 经过行标准化处理及聚类分析，可以比较各个化合物分别在奶酪肽及其美拉德反应产物中的分布差异。明显地，在奶酪蛋白酶解液（P）中含有烷基、部分酸、内酯和乙偶姻，呈现一定的奶油味。在奶酪美拉德反应液中（PH），吡嗪类化合物（9 种）及酮类化合物含量丰富，吡嗪类化合物存在于绝大多数的美拉德反应产物中并占主导地位。由图5b 可知，在奶酪蛋白酶解液中，苯乙酮、癸酸、己酸、乙偶姻及辛酸为主要的挥发性风味物质，苯乙酮有杏仁味和坚果味，乙偶姻有奶油香气[20]。而在奶酪肽美拉德反应物中，2,5-二甲基吡嗪、2-庚酮、2-壬酮及三甲基吡嗪为主导挥发性风味物质。据报道，2,5-二甲基吡嗪提供炒花香气和巧克力、奶油气味，是乌龙茶中的一种关键的烤花生味[21]。短链酮类具有脂肪香味及焦香气味，而长链酮类具有花香，且酮类物质也是美拉德反应中一类重要的挥发性组分。

图5 奶酪酶解液及美拉德反应液的挥发性风味物质热图

3 结 论

实验以模糊数学感官评分、荧光强度及褐变度作为筛选美拉德反应条件的主要指标，确定了奶酪蛋白水解物美拉德反应的最佳工艺条件，此条件制得的样品焙烤味与奶香味协调，风味宜人，以2,5-二甲基吡嗪、2-庚酮、2-壬酮为关键香气化合物。结果表明，模糊数学结合分析感官评价是提升风味品质感官评定方法准确性的有效模式。本实验可为天然奶酪风味物质制备提供理论指导和技术支持。