LINC00943调节miR-331-3p/KMT2A轴对宫颈癌细胞恶性生物学行为和上皮间质转化的影响

葛新苗，高倩，刁丛，温美侠，李帅

(保定市第二中心医院产科,保定 072750)

宫颈癌(CC)是常见的癌症之一,在全球女性发病率中排名第四[1]。对于CC患者,免疫治疗已成为CC治疗的新热点,但其治疗效果仍不理想[2]。由于CC具有高复发性和转移性等特点,导致CC患者总体预后较差。在上皮间质转化(EMT)过程中,细胞外基质(ECM)降解导致肿瘤细胞迁移、侵袭和扩散到各组织继发部位[3]。因此,了解CC发生和发展机制对寻找新的诊断生物标志物和有效治疗方案至关重要。长链非编码核糖核酸(LncRNA)是具有200多个核苷酸的核糖核酸(RNA)转录本,其已被证实与CC的发生及患者的预后密切相关[4]。LINC00943是一种新型的表观遗传转录物[5]。文献报道,CC免疫相关的竞争性内源RNA(ceRNA)网络(包含LINC00943),在细胞增殖、凋亡和程序性细胞死亡中显著富集[6]。微小RNA(miRNA)是高度保守的小非编码RNA,其已成为诊断CC的潜在生物标志物[7]。据报道,miR-331-3p在HeLa细胞中高表达,miR-331-3p靶向调控NRP2抑制CC细胞增殖、迁移和侵袭[8]。此外,研究显示,前列腺癌和胶质瘤中LncRNA UCA1、LncRNA GAPLINC均可通过调节miR-331-3p促进细胞进展[9-10]。赖氨酸甲基转移酶2A(KMT2A)是表观遗传机制的一员,主要负责H3K4甲基化进行转录激活[11]。据报道,敲低KMT2A可抑制CC细胞的增殖和迁移,并抑制肿瘤的生长[12]。然而,LINC00943对CC恶性生物学行为及miR-331-3p、KMT2A的影响尚不清楚。因此,本研究旨在探讨LINC00943在CC中的作用以及具体机制,以期为临床治疗提供理论依据。

材料与方法

一、实验材料

1.细胞及动物来源:正常宫颈上皮细胞Ect1/E6E7和人CC细胞系HeLa、SiHa、C33A、CaSki购自美国ATCC细胞库;4周龄BALB/c裸鼠购自湖北省实验动物研究中心,许可证号:SCXK(鄂)2020—0018。

2.主要试剂:LINC00943短发夹RNA(sh-LINC00943)和阴性对照(sh-NC)、miR-331-3p抑制剂(miR-331-3p inhibitor)和阴性对照(NC inhibitor)、miR-331-3p模拟物(miR-331-3p mimics)和阴性对照(miR-NC)、KMT2A过表达质粒及对照(pcDNA)购自上海科雅生物科技有限公司;Nuclear/Cytosol Fractionation Kit(K266-100)购自上海起源生物科技有限公司;PrimeScript RT试剂盒(RR036A)、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(DRR820A)购自日本TaKaRa公司;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(C1062S)、MTT(C0009S)、Dual-LumiTMⅡ双萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG089S)、Lipo6000TM转染试剂(C0526)购自上海碧云天生物技术有限公司;兔抗人KMT2A多抗(ab272023)、兔抗人E-cadherin单抗(ab76319)、兔抗人N-cadherin单抗(ab76011)、HRP标记的IgG(ab150077)购自英国Abcam公司。

3.主要仪器:荧光倒置显微镜(型号IX71)购自日本Olympus公司;PCR仪(型号:T100TM)、流式细胞仪(型号ZE5)购自美国Bio-Rad公司。

二、研究方法

1.细胞培养:将正常宫颈上皮细胞Ect1/E6E7和人CC细胞系HeLa、SiHa、C33A、CaSki细胞放置在含10% FBS和1%的青链霉素的DMEM中,置于37℃、5% 二氧化碳(CO2)培养箱中培养,每隔1 d更换培养基,待细胞贴壁达70%～80%,用胰蛋白酶进行传代培养,取对数生长期的细胞进行后续实验。

2.细胞转染:将HeLa细胞分为sh-NC组、sh-LINC00943组、sh-LINC00943+NC inhibitor组、sh-LINC00943+miR-331-3p inhibitor组、miR-NC组、miR-331-3p mimics组、miR-331-3p mimics+pcDNA组、miR-331-3p mimics+KMT2A组。收集各组HeLa细胞,用0.25%胰蛋白酶消化重悬,并接种在6孔板中(每孔1.2×106个),待细胞融合度为70%～80%时,使用Lipo6000TM转染试剂盒转染细胞,转染48 h后,提取各组细胞总RNA,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测转染效率。

3.LINC00943在HeLa中的定位:收集HeLa细胞,预冷PBS冲洗,离心后取细胞沉淀,使用Nuclear/Cytosol Fractionation Kit试剂盒分离细胞核、细胞质并提取RNA,RT-qPCR法检测LINC00943表达。

4.RNA pull down实验:将生物化LINC00943探针和HeLa细胞裂解物混合,以非生物化LINC00943探针为对照,加入磁珠于4℃下孵育48 h。提取总RNA,RT-qPCR检测miR-331-3p表达。

5.荧光素酶报告实验:将LINC00943野生型(wt)或突变型(mut)及KMT2A-wt/KMT2A-mut序列克隆到pmirGLO载体中,构建LINC00943-wt/LINC00943-mut、KMT2A-wt/KMT2A-mut质粒,使用Lipo6000TM转染试剂将构建的载体与miR-331-3p模拟物或阴性对照(NC)共转染到HeLa细胞,转染2 d后,采用荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。

6. RT-qPCR实验:TRIzol试剂提取各组细胞总RNA,并利用PrimeScript RT试剂盒反转录成cDNA,按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明进行PCR扩增,RT-qPCR反应条件为:95℃ 5 min,95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,共35个循环,使用2-ΔΔCt法计算LINC00943、miR-331-3p的表达量。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列及产物长度

7.Western blot实验:收集转染后的细胞,提取总蛋白,BCA法测量蛋白浓度后,10% SDS-PAGE分离蛋白,并转移至PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温封闭2 h,加入一抗KMT2A(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000),4℃孵育过夜,洗膜3次后加入HRP标记的二抗IgG(1∶10 000),ECL暗光反应,Image J软件检测蛋白表达。

8.细胞增殖实验:将转染后的细胞接种在96孔板中,每组设置3个复孔,加入MTT溶液,酶标仪检测490 nm处吸光度(OD值)。

9.细胞迁移和侵袭:Transwell小室法检测HeLa细胞迁移和侵袭。将细胞加入无血清DMEM上腔进行细胞迁移,细胞侵袭上腔涂有Matrigel,下腔加入10%胎牛血清的DMEM,孵育24 h,结晶紫染色,显微镜下对迁移和侵袭细胞进行计数。

10.细胞凋亡实验:将转染后的细胞置于96孔板中,室温下孵育48 h,结合缓冲液重悬,加入10 μl Annexin V-FITC和10 μl PI染色,流式细胞仪分析细胞凋亡率。

11.裸鼠体内肿瘤形成实验:4周龄BALB/c裸鼠分别皮下注射200 μl sh-NC或sh-LINC00943慢病毒转染的HeLa细胞,记为sh-NC组或sh-LINC00943组,每组5只裸鼠。4周后,处死小鼠剥离肿瘤,测量肿瘤重量,Western blot检测移植瘤组织中KMT2A、E-cadherin、N-cadherin蛋白水平。实验经过本院动物伦理审查委员会审查。

三、统计学分析

结 果

一、LINC00943在CC细胞系中的表达

RT-qPCR结果显示,与正常宫颈上皮细胞Ect1/E6E7比较,CC细胞系中LINC00943表达显著升高(P<0.05),且HeLa细胞中LINC00943表达水平最高,因此选取HeLa进行后续实验(图1)。

注:与Ect1/E6E7比较,*P<0.05。

二、Hela细胞中LINC00943与miR-331-3p的相互作用

亚细胞分离实验显示,Hela细胞的细胞质中LINC00943的百分比高于细胞核(图2A)。RNA pull down实验显示,Bio-miR-331-3p-wt中,LINC00943高度富集(图2B)。使用Targetscan获得LINC00943与miR-331-3p的结合位点(图2C)。双荧光素酶活性检测显示,与miR-NC组相比较,miR-331-3p mimics加了LINC00943-wt的荧光素酶活性显著降低(P<0.05),加了LINC00943-mut的荧光素酶活性则无显著差异(P>0.05)(图2D)。RT-qPCR结果显示,与sh-NC比较,sh-LINC00943组LINC00943表达显著降低,miR-331-3p表达显著增加(P<0.05);与sh-LINC00943+NC inhibitor组比较,sh-LINC00943+miR-331-3p inhibitor组miR-331-3p表达显著降低(P<0.05)(图2E、图2F)。

A:细胞核和细胞质中LINC00943的表达占比;B:RNA pull-down实验各组LINC00943相对表达量;C:Targetscan分析LINC00943与miR-331-3p的结合位点;D:双荧光素酶基因报告检测LINC00943和miR-331-3p之间的相互作用;E:下调LINC00943后各组细胞LINC00943相对表达量;F:下调LINC00943后,各组细胞miR-331-3p相对表达量。注:与Bio-NC组、miR-NC组或sh-NC组比较,*P<0.05;与sh-LINC00943+NC inhibitor组比较,#P<0.05。

三、下调LINC00943对CC细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和EMT的影响

与sh-NC比较,sh-LINC00943组细胞增殖、迁移和侵袭显著降低,细胞凋亡率显著增加,E-cadherin表达显著上调,N-cadherin表达显著下调(P<0.05);与sh-LINC00943+NC inhibitor组比较,sh-LINC00943+miR-331-3p inhibitor组细胞增殖、迁移和侵袭显著增加,细胞凋亡率显著降低(图3、图4),E-cadherin蛋白表达显著下调,N-cadherin蛋白表达显著上调(P<0.05)(图5)。

图3 下调LINC00943对各组细胞迁移(光镜400×)、侵袭(光镜400×)、凋亡的影响

A:各组细胞增殖曲线图;B:各组迁移细胞数比较;C:各组侵袭细胞数比较;D:各组细胞凋亡灰度图。注:与sh-NC组比较,*P<0.05;与sh-LINC00943+NC inhibitor组比较,#P<0.05。

A:Western blot检测E-cadherin和N-cadherin蛋白表达;B:各组E-cadherin蛋白表达水平比较;C:各组N-cadherin蛋白表达水平比较。注:与sh-NC组比较,*P<0.05;与sh-LINC00943+NC inhibitor组比较,#P<0.05。

四、Hela细胞中miR-331-3p与KMT2A的靶向关系

使用Targetscan预测miR-331-3p与KMT2A存在结合位点(图6A),表明KMT2A是miR-331-3p下游基因。双荧光素酶活性检测显示,与miR-NC组相比较,miR-331-3p mimics组加入KMT2A-wt后,荧光素酶活性显著降低(P<0.05),而KMT2A-mut则无显著改变(P>0.05)(图6B)。RT-qPCR显示,与miR-NC组比较,miR-331-3p mimics组miR-331-3p表达显著增加,miR-331-3p mimics组、miR-331-3p mimics+pcDNA组和miR-331-3p mimics+KMT2A组比较无显著差异(P>0.05)(图6C)。miR-331-3p mimics组KMT2A蛋白表达显著低于miR-NC组,与miR-331-3p mimics+pcDNA组比较,miR-331-3p mimics+KMT2A组KMT2A蛋白表达显著增加(P<0.05)(图7)。

A:Targetscan分析miR-331-3p与KMT2A的结合位点;B:双荧光素酶基因报告检测miR-331-3p与KMT2A的相互作用;C:转染miR-331-3p mimics后,各组细胞中miR-331-3p相对表达。注:与miR-NC组比较,*P<0.05。

A:Western blot检测KMT2A蛋白表达;B:各组KMT2A蛋白表达水平比较。注:与miR-NC组比较,*P<0.05;与miR-331-3p mimics+pcDNA组比较,#P<0.05。

五、miR-331-3p通过调控KMT2A对HeLa细胞增殖、凋亡和EMT的影响

与miR-NC组比较,miR-331-3p mimics组细胞活力、迁移和侵袭显著降低,细胞凋亡率显著增加,E-cadherin表达显著上调,N-cadherin表达显著下调(P<0.05);与miR-331-3p mimics+pcDNA组比较,miR-331-3p mimics+KMT2A组细胞活力、迁移和侵袭显著增加,细胞凋亡率显著降低(P<0.05)(图8、图9),E-cadherin蛋白表达显著下调,N-cadherin蛋白表达显著上调(P<0.05)(图10)。

图8 miR-331-3p通过调控KMT2A对HeLa细胞迁移(光镜400×)、侵袭(光镜400×)和凋亡的影响

A:各组细胞增殖曲线图;B:各组细胞迁移比较;C:各组细胞侵袭比较;D:流式细胞仪检测各组细胞凋亡。注:与miR-NC组比较,*P<0.05;与miR-331-3p mimics+pcDNA组比较,#P<0.05。

A:Western blot检测E-cadherin和N-cadherin蛋白表达;B:各组E-cadherin蛋白表达水平比较;C:各组N-cadherin蛋白表达水平比较。注:与miR-NC组比较,*P<0.05;与miR-331-3p mimics+pcDNA组比较,#P<0.05。

六、体内肿瘤实验

与sh-NC比较,sh-LINC00943组肿瘤重量显著降低,LINC00943表达显著降低,miR-331-3p表达显著增加(P<0.05)(图11);Western blot显示,KMT2A、N-cadherin显著降低,E-cadherin蛋白水平显著增加(P<0.05)(图12)。

A:两组裸鼠体内肿瘤重量比较;B:两组细胞LINC00943表达水平比较;C:两组细胞miR-331-3p表达水平比较。注:与sh-NC组比较,*P<0.05。

A:Western blot检测KMT2A、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达;B:两组细胞KMT2A蛋白表达水平比较;C:两组细胞E-cadherin蛋白表达水平比较;D:两组N-cadherin蛋白表达水平比较。注:与sh-NC组比较,*P<0.05。

讨 论

CC是女性常见的恶性肿瘤之一,尤其在不发达国家发病率较高,CC患者在初次治疗后的最初几年内易发生盆腔复发或远处转移的风险[13],因此,寻找潜在生物标志物对CC治疗和预后至关重要。最近几年内,LncRNA被确定为包括CC在内的多种癌症的重要标志物[14]。研究表明,LncRNA DLEU2通过miR-455-3P/OTUD7B轴激活PI3K/AKT信号通路促进CC的恶性进展[15]。据报道,构建与免疫相关的LINC00943 ceRNA网络,有助于癌症患者存活率的预后评估[16],而有关LINC00943对CC调控机制的研究还未见报道。本研究结果显示,在CC细胞系中LINC00943表达显著上调,其中HeLa细胞中LINC00943表达最高,这是因为HeLa细胞比其它细胞扩增得快。由于HeLa细胞中LINC00943表达最高,敲低LINC00943表达的效果最显著,故选择HeLa细胞进行后续实验。沉默LINC00943可抑制细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡。EMT是上皮细胞向间充质细胞转化的细胞过程。早期肿瘤的转移与EMT密切相关,EMT可加速肿瘤的迁移和侵袭[17]。有研究表明,EMT过程在CC转移和侵袭过程中起主要作用,例如:沉默LncRNALINC01305可以抑制TNXB介导的PI3K/Akt信号通路,从而抑制CC细胞EMT[18]。高表达LncRNA UNC5B-AS1可以增强TLR信号通路,促进CC细胞增殖和EMT能力[19]。本研究结果显示,沉默LINC00943可促进E-cadherin表达,同时抑制N-cadherin表达,提示沉默LINC00943可抑制EMT,发挥抑癌作用。

LncRNA可作为ceRNA抑制miRNA表达,进而调控癌症的生物学行为[20]。Buranjiang等[21]研究显示,LncRNAHOTAIR通过海绵化miR-331-3p增强染色体凝缩调控因子2(RCC2)表达,加速CC进展。本研究发现,LINC00943主要分布在细胞质中,且与miR-331-3p存在靶向关系。已证实,miR-331-3p可以调节肿瘤的进展,并可作为独立的预后因素。相关研究表明,miR-331-3p在CC中高表达,LncRNAXLOC-006390可作为ceRNA反向调节miR-331-3p和miR-338-3p的表达,促进CC的发生和转移[22]。本研究结果显示,过表达miR-331-3p可抑制CC增殖、迁移、侵袭和EMT,促进细胞凋亡,而LINC00943可负调控miR-331-3p的表达,促进CC恶性生物学行为发生,抑制miR-331-3p表达可逆转沉默LINC00943表达对CC增殖、迁移、侵袭和EMT的抑制作用。

KMT2A是具有H3K4甲基转移酶活性的转录共激活剂,可以调节癌症细胞活力、迁移和凋亡。据报道,KMT2A的高表达与肿瘤患者的不良预后有关[23]。敲低KMT2A表达可抑制黑色素瘤细胞的活力和肿瘤球的形成[24]。在骨髓增殖性肿瘤中,检测到KMT2A阳性率显著增加,其突变体KMT2A G3131S可促进细胞增殖和菌落形成能力[25],但是,KMT2A在CC上的作用机制鲜有报道。本研究发现,过表达KMT2A可逆转miR-331-3p上调对CC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的抑制作用。体内研究表明,沉默LINC00943可抑制肿瘤生长和EMT,并下调KMT2A表达,与体外实验结果一致。提示沉默LINC00943可通过负调控miR-331-3p降低KMT2A表达,抑制CC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT,促进细胞凋亡。

综上所述,LINC00943在CC细胞中高表达,当其表达下调时,可以通过调控miR-331-3p/KMT2A轴抑制CC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT,诱导细胞凋亡。但LINC00943与CC临床患者中的病理特征和预后的关系仍有待深入研究。