土壤微生物环保修复技术的具体应用

王 骏，蒋莎莎，余 敏

（1.浙江交科环境科技有限公司，浙江 杭州 310000；2.温岭市环境综合整治事务中心，浙江 台州 317500；3.浙江秀水环保有限公司，浙江 杭州 310000）

0 引言

土壤污染作为一种非常复杂的环境问题，其具有隐蔽性、潜伏性、持续性、广泛性等特点，如果不对其进行有效治理，将会产生严重的环境污染后果。随着我国城市化进程的不断加快，城市垃圾、工业废弃物、农药化肥等各种固体废弃物源源不断地流入农村地区，在不断的积累下，这些固体废弃物已经严重污染了土壤环境[1]。土壤污染已经成为了我国农村地区主要的环境问题之一，也是影响我国农业发展和农村经济发展的主要原因之一。近年来，国家也开始高度重视土壤污染问题，并将其作为农业可持续发展战略的重要组成部分进行全面推进。

1 实验部分

1.1 实验材料与设备

实验土壤：从某石油化工管线输送公司的工厂场地中采集，经过14 d 的陈化后，用30 目（0.613 mm）筛筛选后将其冷冻、干燥处理，并置于4℃的避光室中保存，称为CK。该土壤为粉砂质壤土，其石油烃含量为16 622.89 mg/kg，pH 值为8.37，含水量为1.57%，电导率为154 μS/cm，有机质质量分数为3.7%，氧化还原电位为86 mV，阳离子交换容量为0.088 mol/kg，总碳质量分数为3.8%，总氮含量为937 mg/kg，以及总磷含量为720 mg/kg。

用于TPHs 降解的特定细菌：通过内部培养及筛选技术，获得一株能在低温环境（＜15 ℃）下生长的细菌株，归类于霍氏肠杆菌属，本实验中标记为GZ6。该种细菌不仅能够合成生物表面活性物质，而且能够对三氯苯酚进行降解[2]。

实验试剂包括过硫酸钠、铁粉、FeSO4·7H2O、正己烷、丙酮、β-环糊精。

实验仪器包括气相色谱仪、便携式ORP/DO/pH/EC仪、可见光分光光度计、气象色谱-质谱联用仪等。

1.2 实验设计

采用过硫酸盐氧化（PS 氧化）和过硫酸盐氧化-微生物（PS 微生物）修复两种方案，每种实验方案均设置实验组和对照组。其中，PS 氧化实验方案对照组将1.5%的PS、0.071%的铁粉和0.876%的FeSO4·7H2O（其中百分数分别为对应物质的质量分数，下同）的溶液混合后加入实验土壤汇总，土壤和实验药剂质量比为10∶（8～10），该对照组记为OX1。实验组在OX1 的基础上加入0.357%的β-环糊精螯合剂，该实验组记为OX2；PS 微生物实验方案对照组与OX1相同，同时采用土著菌微生物修复土壤，记为CB。实验组与OX2 相同，微生物采用GZ6 菌，记为CMB。

在PS 微生物修复实验流程中，0～12 d 设定为PS氧化修复阶段，随后的13～17 d 为过渡期，此时土壤完成PS 氧化后接受微生物修复的准备，而从18～60 d则为微生物修复阶段。

1.3 分析方法

1.3.1 土壤理化特性分析

对于土壤中的总石油烃（TPHs）含量，采用HJ 1021—2019 标准的气相色谱法进行定量分析；土壤的电导率（EC）依照HJ802—2016 标准的电极法进行测量；为评估土壤的氧化还原电位（ORP），执行HJ 746—2015 标准的电位法；土壤pH 值的测定遵循HJ 962—2018 标准的电位法；使用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）检测土壤微生物修复阶段中分解代谢产物的变化[3]。

1.3.2 土壤酶活性分析

用改良三苯基四唑氯化物还原方法（按三苯基甲胺1 h 内在1 g 土壤中的产出率计算）检测土壤中的脱氢酶活力；土壤中脂解酶活性的测定采用分光光度测量技术；同时，数据的统计和基因序列的比对分析则利用SOAP aligner 软件平台进行。

2 结果与讨论

2.1 土壤中TPHs 及其组分的修复期变化情况

2.1.1 TPHs 的时序变化趋势

图1 为不同处理时期污染土壤中石油烃含量变化情况。从图1 可以看出，经过PS 氧化实验后，PS 微生物实验土壤中TPHs 含量呈现快速下降趋势；当经过12d 的处理后，CB 和CMB 处理的土壤中TPHs 含量从初始的16 521.76 mg/kg 降至7 523.61 mg/kg 和7 848.80 mg/kg，去除率分别达到了53.9%和52.7%。结果表明，在PS 氧化实验的早期阶段，β-环糊精对于TPHs 降解的促进作用并不明显。可能是由于螯合剂及土壤中的有机质与污染物之间发生了自由基竞争作用，从而影响了PS 的有效利用率。

图1 污染土壤中TPHs 含量随修复时间的变化

随着修复进程的延续，CB 与CMB 处理策略下的TPHs 水平持续降低。在处理的第60d，CB 与CMB 方法处理后的土壤TPHs 含量分别降至4 632.61 mg/kg和2 715.76 mg/kg，对应的TPHs 去除效率达到了72.1%和82.3%。与CB 方案相比，CMB 方案在去除TPHs 方面的效率提升了29.6%，显著优于CB 方案。

CB 方案中采用了铁离子（Fe2+）激活的氧化微生物修复策略，而CMB 方案结合了β-环糊精螯合铁离子激活的氧化微生物。通过两种策略的比较分析，明显可以看出β-环糊精通过螯合Fe2+延长了激活剂的作用时间，并减缓了游离基团对土壤和微生物的负面影响，从而为微生物修复创造了有利条件。此外，引入GZ6 功能性微生物不仅为生物修复和化学氧化的间隔期提供了降解石油烃的有效菌种，还能通过降低原油的表面张力来增强石油的溶解性和降低黏度，进而提升对TPHs 的降解能力。

2.1.2 TPHs 馏分变化

图2 为受污染的土壤中，各种TPHs 组份的含量随时间变化情况。TPHs 各组份的降解性从大到小分别是C31～C40、C18～C30、C10～C17。

图2 污染土壤中不同TPHs 馏分含量的变化

从图2 可以看出，CK 中，C10～C17 馏分的含量为10 986.69 mg/kg，含量最高；C31～C40 馏分的含量为169.29 mg/kg，含量最低；C18～C30 馏分的含量为5 398.01 mg/kg；PS 对OX1 和OX2 的馏分进行了深度氧化后，OX1 中C10～C17 的脱除率达到了45.1%，OX2 中C10～C17 的脱除率达到了71.2%。

在实验期60 d 内，CB 实验方案中C10～C17 馏分的总含量为2 594.05 mg/kg 脱除率为76.1%；C18～C30 的总含量为2 048.30 mg/kg，脱除率为79.1%；C31～C40 的总含量为36.15 mg/kg，脱除率为78.9%；CMB 实验方案中C10～C17 馏分总含量为1 321.53 mg/kg，脱除率为87.8%；C18～C30 馏分总含量为1 426.55 mg/kg，脱除率为74.1%；C31～C40 馏分为41.29 mg/kg，脱除率为73.1%。

与CB 实验方案相比，CMB 实验方案中C10～C17和C18～C30 去除率有较大幅度的提升，提升幅度分别为12%、11.5%，由此可见CMB 实验方案修复土壤效果优于CB 实验方案。

通过气相色谱-质谱联用技术对TPHs 的分解产物进行分析。检测到的降解产物类别包括长链烷烃、烯烃、支链烷烃、芳香烃以及环烷烃等类型，具体化合物涵盖环己烷、邻苯二甲酸酯、苯酚、C15～C20 的长链烷烃以及其他支链化合物，其中主要以中链烷烃为主要成分。长链烷烃（C25～C40）因其为固态疏水性化合物、溶解度较低而难以被生物作用降解；然而，GZ6 菌株能通过分泌生物表面活性剂来增加TPHs 的溶解度，从而提升其降解效率。

2.2 修复期间土壤化学性质的变化

图3 为不同处理时期的土壤pH 值、EC 值和ORP 值的变化情况。从图3-1 可以看出，在PS 氧化期，CB 和CMB 两种修复方案中土壤的pH 值都有较大幅度的下降，在12 d 后，pH 值从最初的8.25 分别下降到7.79 和7.80；在修复时间60 d 后，两种修复方案下的土壤pH 值分别上升到7.86 和7.90。

图3 土壤pH、EC、ORP 随修复时间的变化

从图3-2 可以看出，在PS 氧化期，CB 和CMB 实验方案的土壤中的EC 都有较大幅度的增长，在12 d修复期间，EC 由152.4 μS/cm 的最初值分别上升到3 018 μS/cm 和3 101 μS/cm。EC 急剧增加由于在修复过程中引入的亚铁活化剂和PS 氧化作用生成了额外的离子，这些离子的增多导致EC 值的显著提高。随着修复治疗的持续，硫酸根（SO42-）和钙离子（Ca2+）等可能会以矿物的形式沉淀，同时部分可溶解的矿物质会被微生物吸收并代谢。当修复时间达到60d 的时候，CB 和CMB 土壤的EC 逐步下降到1 449 μS/cm和1 720 μS/cm。

从图3-3 可以看出，在PS 氧化期，CB 和CMB 两种实验方案的土壤中的ORP 快速升高，在12 d 后，ORP 从最初的86 mV 分别升高到126 mV 和145 mV；在60 d 后，CB 实验方案的ORP 值达到162 mV，而CMB 实验方案的ORP 值则达到169 mV。CMB 实验方案的ORP 较CB 有显著升高，主要是由于GZ6 与土壤降解菌群之间存在着相互协作关系，从而增加了TPHs 的生物可利用性，并提高了微生物的总呼吸速率，因此CMB 实验方案的ORP 值高于CB 实验方案。

2.3 土壤酶活性变化

图4 为不同处理时期，不同处理条件下土壤中的脱氢酶、脂酶活性变化情况。从图4-1 可以看出，在PS 氧化阶段，残留在土壤中的SO42-、Fe3+、Na+会干扰细胞的渗透平衡，导致脱氢酶活性降低。经过24 d 的修复，脱氢酶活性观测到显著的峰值，CB 实验方案的土壤中脱氢酶活性为2.66 μg/g，CMB 实验方案的土壤中脱氢酶活性为2.94 μg/g。

修复时间延长，土壤中可供微生物利用的碳源逐步消耗，与此同时脱氢酶活性也出现下降趋势。在土壤中，脂肪酶的活力也呈现出类似于脱氢酶的变化趋势（如图4-2 所示）。在48d 的修复过程中，CB 和CMB实验方案中的脂肪酶活性最高，分别为195.4 μg/g，218.5 μg/g。结果表明，在中等或较低的氧化剂浓度下，酶活性被激活，当其活性达到最大值时，TPHs 降解效率提高。

3 结论

本实验采用过硫酸盐氧化（PS 氧化）和过硫酸盐氧化-微生物（PS 微生物）修复两种方案，对土壤理化性质和酶活性的分析。

1）CB 和CMB 实验方案中，TPHs 含量呈现快速下降趋势；在60d 后，C10～C17 的脱除率达到了45.1%，OX2 中C10～C17 的脱除率达到了71.2%。另外，GZ6 功能菌可以增强其对TPHs 的降解效果。

2）CMB 处理后24 d 及48 d，脱氢酶及脂肪酶的活性达2.94、218.5 μg/g，与CB 处理后的脱氢酶及脂肪酶的活性2.69、196.5 μg/g 相比，分别增加了0.25、22.8 μg/g。通过预氧化作用，激活菌株中的脂类及脱氢酶，加速THPs 胞外酯基团的裂解，可以增强其溶解性，进而加快TPHs 的生物降解。