气相色谱法测定酱油中对羟基苯甲酸甲酯的不确定度评定

崔婷婷，乔牡冬

（中国地质调查局呼和浩特自然资源综合调查中心，呼和浩特 010010）

酱油由多种谷物多种工艺酿造而成，是生活中常用的调味品[1-2]，酱油中常添加一定的防腐剂用于保鲜，我国国家标准GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》规定使用的防腐剂有26种，其中对羟基苯甲酸甲酯属于对羟基苯甲酸酯类。对羟基苯甲酸甲酯(尼铂金酯)为白色结晶粉末，具有抗菌功能，应用范围广，毒性低[3-4]，可以穿过细胞膜，让蛋白质变性，抑制细胞的呼吸酶活性和传递酶活性，起到防腐作用[5-6]，应用于化妆品、食品等行业[7]。对羟基苯甲酸甲酯毒性较低，比钠盐、山梨酸、苯甲酸防腐效果好并且稳定，常作为防腐剂使用。过量使用防腐剂可能会对人体造成伤害，影响生育能力[8]。目前，国家对于食品中添加防腐剂的量有严格的控制，GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中明确规定：酱油中对羟基苯基酸甲酯的最大使用量为0.25 g/kg。当前，对于对羟基苯甲酸甲酯的检测方法有气相色谱法[9]、液相色谱法[10-11]、气相色谱-质谱法[12]。酱油中的对羟基苯甲酸甲酯在检测过程中，检测结果与使用限量可能会接近，甚者则超过临界值，测定数据的准确性严重影响实验人员对于结果的判断，所以针对酱油中对羟基苯甲酸甲酯含量测定的不确定度评定，可以更加客观、合理地评价检测结果[13-15]。

依据国家标准GB 5009.31—2016《食品安全国家标准 食品中对羟基苯甲酸酯类的测定》，利用气相色谱仪检测酱油中对羟基苯基酸甲酯的含量。按照JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》和JJG 196—2006《常用玻璃量器鉴定规程》要求，对检测结果的不确定度进行评估，分析不确定度的主要来源，通过对酱油样品重复测定、酱油样品称量、对羟基苯基酸甲酯标准溶液量取、对羟基苯基酸甲酯标准溶液纯度、对羟基苯基酸甲酯标准溶液配制过程中所使用的玻璃器具、标准曲线拟合引入的不确定度进行评定，以期提供科学、合理的检测数值，从而提高检测结果的准确性，保证最终结果的可靠性。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱仪：GC-2010 型，日本岛津企业管理(中国)有限公司。

电子天平：BSA200S-WEⅠ型，感量为0.001 g，德国赛多利斯公司。

超纯水机：XYG-90-H 型，北京湘顺源科技有限公司。

对羟基苯甲酸甲酯标准溶液：1 000 μg/mL，批号为80699JA，坛墨质检科技股份有限公司。

丙酮、乙醚：均为色谱纯，天津市富宇精细化工有限公司。

无水乙醇：色谱纯，天津市北联精细化学品开发有限公司。

盐酸：色谱纯，天津市汇源化工有限公司。

氯化钠、碳酸氢钠：分析纯，天津市津东天正精细化学试剂厂。

硫酸钠：分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

准确量取对羟基苯甲酸甲酯标准溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成质量浓度为100 μg/mL的对羟基苯甲酸甲酯中间液。用移液管分别吸取对羟基苯甲酸甲酯中间液5、2、1、0.4 mL于10 mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成质量浓度分别为50、20、10、4 μg/mL 的对羟基苯甲酸甲酯系列标准工作溶液。

1.2.2 样品处理

采用国家标准GB 5009.31—2016《食品安全国家标准 食品中对羟基苯甲酸酯类的测定》方法处理酱油样品，采取直接取样的方法，称取5 g (精确至0.001 g)酱油样品于小烧杯中，并转移至125 mL 分液漏斗中，用10 mL 饱和氯化钠溶液分次洗涤小烧杯，合并洗涤液于125 mL分液漏斗，加入1 mL盐酸溶液(37%浓盐酸和水体积比为1∶1)酸化，摇匀，分别以75、50、50 mL 无水乙醚各提取1 次，每次2 min，放置1～2 min，弃去水层，合并乙醚层于250 mL分液漏斗中，加入10 mL饱和氯化钠溶液洗涤一次，再分别以碳酸氢钠溶液30、30、30 mL洗涤三次，弃去水层。用滤纸吸去漏斗颈部水分，将有机层经过无水硫酸钠(约20 g)滤入浓缩瓶中，在旋转蒸发仪上浓缩近干，用氮气除去残留溶剂，准确加入2.0 mL无水乙醇溶解残留物，作为样品溶液。

1.2.3 气相色谱仪工作条件

色谱柱：HP-5 毛细管柱[30 m×0.25 mm，0.25 μm，日本岛津企业管理(中国)有限公司]；进样口温度：220 ℃；检测器温度：260 ℃；分流比：10∶1；色谱柱流量：1.0 mL/min；H2流量：40 mL/min；尾吹气流量：3 mL/min；空气流量：400 mL/min；程序升温：100 ℃保持1 min，以20 ℃/min 升温至170 ℃，再以12 ℃/min 升温至220 ℃，保持10 min，以10 ℃/min升温至250 ℃，保持6 min；定量方法：色谱峰面积外标法。

1.2.4 测量模型

依据GB 5009.31—2016《食品安全国家标准 食品中对羟基苯甲酸酯类的测定》测定酱油样品中对羟基苯甲酸甲酯的含量，按照式(1)进行计算：

式中：wx——酱油样品中对羟基苯甲酸甲酯的质量分数，mg/kg；

ρ——由标准曲线计算的样品溶液中对羟基苯甲酸甲酯的质量浓度，μg/mL；

V——定容体积，mL；

f——换算因子，0.907 8；

m——酱油样品质量，g。

2 测量不确定度来源

根据1.2.4测量模型和检测过程分析，酱油中对羟基苯甲酸甲酯含量测量不确定度的来源有：(1)酱油样品重复测定引入的不确定度；(2)酱油样品称量引入的不确定度；(3)对羟基苯甲酸甲酯标准溶液量取引入的不确定度；(4)对羟基苯甲酸甲酯标准溶液浓度引入的不确定度；(5)对羟基苯甲酸甲酯标准溶液配制过程中所使用的玻璃器具引入的不确定度；(6)标准曲线拟合过程引入的不确定度。

3 不确定度分量的评定

3.1 样品重复测定引入的相对标准不确定度urel(R)

样品重复测定属于A类不确定度。空白酱油样品加入对羟基苯甲酸甲酯标准溶液(20 μg/mL)，6次重复检测(n=6)，测定值(ρi)分别为20.894、19.928、18.428、18.804、18.497、18.560 μg/mL，平 均 值ρˉ=19.185 μg/mL。重复测定引入的不确定度为u(R)按照贝塞尔公式计算：

将测定数据代入式(2)，计算结果为：

3.2 样品称量引入的相对标准不确定度urel(m)

使用BSA200S-WEⅠ电子天平称量酱油样品，依据其检定校准证书，最大允许误差为0.5 mg。按照矩阵分布评定，扩展因子k= 3，其标准不确定度u(m)=0.5/k=0.289 mg，酱油样品称样质量(m)为5.017 g，则称量酱油样品引入的相对标准不确定度：

3.3 标准溶液量取引入的相对标准不确定度urel(Vs，0)

单标线移液管1.0 mL 量取对羟基苯甲酸甲酯标准溶液，最大允许误差0.005。按照矩阵分布评定标准不确定度，k= 3，则对羟基苯甲酸甲酯标准溶液量取引入的标准不确定度为u(Vs，0)=0.005/k=0.002 887 mL，对羟基苯甲酸甲酯标准溶液量取为1.0 mL，则：

3.4 对羟基苯甲酸甲酯标准溶液浓度引入的相对标准不确定度urel(ρs，0)

由对羟基苯甲酸甲酯标准溶液证书可知，质量浓度标准值ρs=1 000 μg/mL，相对扩展不确定度为2%(k=2)，则相对标准不确定度：

3.5 对羟基苯甲酸甲酯标准溶液配制过程所用玻璃器具产生的相对标准不确定度urel(Vs)

实验过程中玻璃器具的主要不确定度为温度和容量允许误差(δ)。实验具体操作温度为25 ℃，而国家计量技术规程JJG 196—2006《常用玻璃量器鉴定规程》中检定温度要求为20 ℃，实验过程中的玻璃器具检定温度与实际操作温度相差5 ℃，只需考虑液体的体积膨胀[16]。对羟基苯甲酸甲酯标准溶液的溶剂为丙酮，丙酮的膨胀系数为0.001 49 ℃-1，则温度变化产生的标准不确定度为u(VT)=(0.001 49×5×V)/k(V为玻璃器具规格，按均匀分布计算k= 3)；容量允许误差(δ)引入的标准不确定度为u(Vδ)=δ/k(按均匀分布k= 3)，则合成标准不确定度为u(Vs，i)=相 对 标 准 不 确 定 度 为urel(Vs，i)=u(Vs,i)/Vs,i。对羟基苯甲酸甲酯标准溶液中间液稀释过程按照1.2.1标准溶液配制，共使用10 mL容量瓶5 次，1 mL 移液管2 次，0.5、2、5 mL 移液管各1 次。配制对羟基苯甲酸甲酯标准溶液时玻璃器具校准引入的不确定度见表1。根据表1数据，对羟基苯甲酸甲酯标准溶液配制中玻璃器具引入的相对标准不确定度：

表1 玻璃器具引入的不确定度Tab.1 Uncertainty introduced by glassware

将各不确定度分量数据带入公式(3)，计算得：

3.6 对羟基苯甲酸甲酯标准曲线拟合过程产生的相对标准不确定度urel(L)

根据GB 5009.31—2016《食品安全国家标准 食品中对羟基苯甲酸酯类的测定》，分别配制并测定5种不同浓度的对羟基苯甲酸甲酯标准溶液，利用对应色谱峰面积的对数Y及溶液质量浓度ρ数据进行线性回归，得标准曲线线性方程为Y=0.007 947 80ρ，相关系数r=0.998，标准曲线数据见表2。

表2 标准曲线数据Tab.2 Standard curve data table

对空白酱油样品加入对羟基苯甲酸甲酯进行6次重复检测，平均质量浓度ρˉ为19.185 μg/mL，由标准曲线拟合的相对标准不确定度按(4)计算：

式中：s——对羟基苯甲酸甲酯标准溶液峰面积的标准

P——样品平行检测次数，P=6；

n——对羟基苯甲酸甲酯标准溶液检测次数，n=6；

ρˉ标——标准系列溶液的平均质量浓度，ρˉ标=36.047 8 μg/mL。

将上述带入公式(4)计算，标准曲线拟合引入的标准不确定度u(L)=0.000 011 μg/mL，相对标准不确定度urel(L)=u(L)/ρ=0.000 001。

3.7 合成相对标准不确定度urel(ρx)

综上，试验过程中，影响检验结果的各个因素引入的相对标准不确定度见表3。由表3可知，酱油样品重复性测定、酱油样品称量是不确定度的主要来源，而对羟基苯基酸甲酯标准溶液量取、对羟基苯基酸甲酯标准溶液纯度、对羟基苯基酸甲酯标准溶液配制过程中所使用的玻璃器具、标准曲线拟合引入的不确定度影响不大。

表3 相对标准不确定度一览表Tab.3 List of relative standard uncertainty

合成相对标准不确定度：

将各不确定度分量数据带入公式(5)，计算得urel(ρx)=0.080 280。无对羟基苯甲酸甲酯的酱油空白样品加入对羟基苯甲酸甲酯标准溶液，测得平均值为ρˉ=19.185 μg/mL，酱油样品最后注入气相色谱仪的定容体积V=2.0 mL，样品取样质量为5.017 g，换算因子f为0.907 8，根据1.2.4测量模型，对羟基苯甲酸甲酯的平均质量分数为6.94 mg/kg。

合成标准不确定度：

3.8 扩展不确定度U

酱油中对羟基苯甲酸甲酯含量测定的扩展不确定度为U=ux×k=3.080 325 mg/kg (置信概率P=95%，包含因子k=2)。

3.9 结果报告

气相色谱法测定空白酱油样品加入20 μg/mL对羟基苯甲酸甲酯标准溶液，重复测定6次，其平均含量为(6.94±3.08) mg/kg，k=2。

4 结语

利用气相色谱法测定酱油中对羟基苯甲酸甲酯的含量过程进行不确定度评定，酱油样品重复性测定、酱油样品称量是不确定度的主要来源，而对羟基苯基酸甲酯标准溶液量取、对羟基苯基酸甲酯标准溶液纯度、对羟基苯基酸甲酯标准溶液配制过程中所使用的玻璃器具、标准曲线拟合引入的不确定度影响不大，因此在测定过程中，实验人员实验过程中，注意标准操作，避免由于个人原因带来的误差，最大程度地保证实验过程中操作的严谨性，从而提高检测准确性。