成骨分化中的铁死亡在骨质疏松发病机制中的研究

刘祥辉 彭国璇 彭洪成 林圆 曾令云 雷安毅 黄明智,*

1.贵州医科大学,贵州 贵阳 550025

2.贵州医科大学附属医院,贵州 贵阳 550004

骨组织是一种活跃的代谢组织,它通过持续的重建来维持其矿化平衡及自身的结构完整。在骨重建周期中,成骨细胞与破骨细胞分别诱导的骨形成和骨吸收紧密耦合。骨重建功能障碍则常常引发包括骨丢失、骨硬化等多种疾病,如骨质疏松症(osteoporosis,OP)、骨硬化症和Paget’s骨病。OP是以骨量减少,骨质量受损及骨强度降低,导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病[1]。随着我国逐步步入老龄化社会,OP的患病率呈现明显的上升趋势。据相关流行病学调查显示,我国50岁以上人群OP患病率为19.2%,其中男性为6.0%,女性为32.1%;65岁以上人群OP患病率为32.0%,其中女性为51.6%,男性为10.7%[2]。OP已成为中国公共卫生的一个重要问题。

铁是一种人体必需的微量元素之一,它在氧气的运输和储存、线粒体功能以及酶的活性中都起着至关重要的作用。早在2012年,哥伦比亚大学Dixon等[3]发现一种Ras选择性致死化合物,即erastin,该化合物可以特异性诱导Ras突变细胞死亡,区别于细胞凋亡、坏死、自噬等死亡方式,这种新的细胞程序性死亡具有铁离子依赖性,称之为铁死亡。随着研究的广泛展开,研究者们已发现铁死亡在神经系统疾病、心脏疾病、肝脏疾病、胃肠道疾病、肺部疾病、肾脏疾病、胰腺疾病等多种系统疾病中发挥着重要作用[4]。此外,相关研究还证实了铁过载和铁死亡在调节成骨分化方面发挥了关键作用。这些发现进一步加深了对铁死亡机制的理解,并揭示了其在骨骼健康和骨代谢方面的重要性。本文拟从铁死亡发生机制及其在成骨分化中的作用研究展开论述,旨在为OP的临床治疗提供理论依据。

1 铁死亡

1.1 铁代谢与铁死亡

在人体内,铁离子以Fe2+的形式被小肠吸收或从血红素中释放,然后被氧化为Fe3+。接着,携带Fe3+的转铁蛋白(transferrin,Tf)会与质膜上的转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TFR1)结合。质膜形成囊泡以吸收携带Fe3+的Tf进入细胞,然后囊泡中的低pH诱导Fe3+从Tf中被剥离。脱落的Fe3+被前列腺六跨膜上皮抗原3(six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3,STEAP3)还原为Fe2+,然后通过二价金属离子转运蛋白1(divalent metal transporter 1,DMT1)介导Fe2+释放到细胞内不稳定铁池(labile iron pool,LIP)[5]。过量的Fe2+会被转运到细胞外,并储存在铁蛋白中。生理状态下,铁蛋白以惰性形式储存细胞内铁,其惰性状态不能促进脂质过氧化[6]。而当核受体共激活因子4(nuclear receptor co-activator 4,NCOA4)介导的铁蛋白自噬降解(铁蛋白吞噬)释放大量Fe2+时,就会增加细胞不稳定的铁含量,从而诱发铁过载[7]。铁过载状态下,LIP中过量的Fe2+可通过芬顿反应(Fenton reaction)和哈伯-韦斯反应(Haber-Weiss reaction)产生活性氧(reactive oxygen species,ROS),从而诱发铁死亡[8]。系统调节铁离子的主要因素是铁调素(Hepcidin),这是一种由肝脏分泌产生的铁调节激素[9]。铁调素会与膜铁转运蛋白1(ferroportin 1,FPN1)结合,通过引起其内化来降低其活性,导致细胞铁的输出减少,减轻组织铁过载[10]。细胞内铁离子的调节则取决于铁调节蛋白(iron regulatory protein,IRP)/铁反应元件(iron response element,IRE)系统。当铁缺乏时,活跃的IRP会与IRE结合,这会增加铁的吸收和利用[11]。这一机制可以维持人体内环境及细胞内的铁稳态。

近期,Yang等[12]发现内皮细胞分泌的外泌体(endothelial cell-secreted exosomes,EC-Exos)可以通过抑制铁蛋白自噬降解导致的铁过载来降低铁死亡对细胞造成的损伤程度,逆转了糖皮质激素对成骨细胞的成骨抑制作用。因此,铁蛋白吞噬释放铁而导致的铁过载可能是铁死亡的必要条件。去铁胺(Deferoxamine,DFO)是一种铁螯合剂,也可以抑制细胞内铁过载引起的铁死亡[13]。此外,Brown等[14]的研究发现,参与脂质动力学调节的五跨膜蛋白prominin2蛋白可以促进含铁蛋白的多泡体(multivesicular bodies,MVB)和外泌体的形成,这些外泌体将铁转运出细胞,抑制铁死亡。

1.2 铁死亡中的脂质过氧化

谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)被认为是调节细胞铁死亡的一种关键分子,其主要作用是将还原型谷胱甘肽转化为氧化型谷胱甘肽,并将细胞毒性LPO(L-OOH)还原为相应的醇类(L-OH)。谷胱甘肽由甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸组成的抗氧化剂,以还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的形式广泛存在于细胞中[15]。其在氧化应激反应中发挥重要的作用。一种由两个亚基SLC7A11和SLC3A2以二硫键连接的异二聚体-胱氨酸/谷氨酸反向转运体(cystine/glutamate antiporter,system Xc-)将细胞外胱氨酸转运到细胞内,并进一步将其转化为半胱氨酸,然后用于谷胱甘肽的生物合成,以维持氧化还原稳态[16-17]。Jiang等[18]研究发现,p53蛋白可通过抑制system Xc-的关键成分SLC7A11的表达,抑制胱氨酸摄取并使细胞对铁死亡敏感。GPX4不足导致LPO产生过多,而LPO则是细胞铁死亡的直接执行者。相关研究证实铁死亡诱导剂磷酸化酶激酶G2可调节脂氧合酶(lipoxygenases,LOX)活性,进而通过抑制GPX4活性,促进多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)的过氧化来驱动铁死亡,表明PUFA可能是铁死亡细胞脂质过氧化的重要靶点[19]。酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)和LOX是促进脂质过氧化和铁死亡的两种核心酶。ACSL4对于含多不饱和脂肪酸的磷脂(polyunsaturated fatty acid-containing phospholipids,PUFA-PL)的生成至关重要。具体来说,ACSL4负责将辅酶A酯化为游离脂肪酸,尤其是对花生四烯酸(arachidonoyl,AA)和肾上腺素酰(adrenoyl,AdA)等长链PUFA的生成有明显的促进作用。随后,ACSL4进一步促进AA和AdA酯化生成磷酯酰乙醇胺(phosphatidylethanolamines,PEs)[20-21]。生成的PEs可被LOX催化氧化,产生磷脂氢过氧化物和包括4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)在内的活性醛。4-HNE和MDA是显著的毒性产物,可与DNA碱基、蛋白质和其他亲核分子反应,导致严重的细胞毒性[22]。

2 成骨细胞铁死亡与OP

2.1 成骨细胞铁死亡

成骨细胞通过合成多种骨基质蛋白在骨形成中发挥核心作用。早期研究表明,铁过载通过减少成骨细胞增殖和分化而出现明显的骨重建抑制,并引发OP[23],这进一步支持了“铁蓄积”假说,即高铁水平是OP的危险因素。随后的研究发现氧化应激引起的成骨细胞功能障碍在OP的病理生理学中也起着重要作用。通过降低成骨细胞氧化应激水平,可促进其生长并减轻OP的发展[24]。随后又有相关研究报导铁可能是通过细胞内铁浓度增加而导致更高的氧化应激水平,从而抑制成骨细胞的功能[25]。Zhao等[26]发现,白藜芦醇逆转过量铁所致的骨形成障碍是通过上调转录因子FOXO1的水平,维持小鼠体内氧化还原水平所实现的。Tao等[27]发现,水飞蓟宾可以抑制铁过载的不良影响,并通过改变骨代谢和氧化应激水平来促进成骨细胞的增殖和分化,并增加其碱性磷酸酶的分泌和矿化能力。这些实验表明减轻成骨细胞氧化应激水平可以减轻铁过载对其的活性抑制。

过量铁与氧化应激导致的成骨细胞活性下降与铁死亡的机制不谋而合。随后的研究也证实了过量的铁积累以及氧化应激会诱导成骨细胞的铁死亡,损害其功能,最终导致OP的发生。例如,Jiang等[28]通过实验证明铁过载诱导MC3T3-E1细胞(小鼠胚胎成骨细胞前体细胞)的铁死亡,从而抑制了MC3T3-E1细胞的体外成骨分化和矿化。Zhang等[29]的研究发现NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,NOX4)位点包含IRE序列,这些序列通常被IRP蛋白结合并抑制,与铁结合诱导IRP从IRE序列上解离,从而激活NOX4转录。NOX4升高增加脂质过氧化物积累。因此,过量铁积累可引起NOX4在骨骼积累,造成成骨细胞铁死亡以及随后OP的发生。此外,另一项近期的研究发现地塞米松通过抑制SLC7A11和GPX4的表达,诱导p53表达升高,从而降低细胞内谷胱甘肽等细胞内抗氧化系统的活性,使MC3T3-E1细胞出现一系列铁死亡征象[30]。Zhu等[31]发现高脂肪饮食导致小鼠股骨骨质流失,随后他们研究发现高脂肪饮食主要影响骨髓腔中幼稚型成骨细胞增殖和成骨分化导致骨质流失,铁死亡抑制剂则会抑制这种影响,这表明高脂肪饮食可能通过成骨细胞铁死亡引起骨质流失。并且晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)也可以通过诱导成骨细胞铁死亡来破坏成骨细胞的功能,从而促进OP[32]。近期有研究者发现高糖和高脂肪诱导的成骨细胞铁死亡可能是通过激活METTL3/ASK1-p38信号通路导致糖尿病性OP[33]。而激活转录因子3(activating transcription factor3,ATF3)则可通过介导system Xc-的活性抑制诱导高糖条件下的成骨细胞铁死亡[34]。此外,Wang等[35]也通过研究发现谷胱甘肽代谢和铁死亡途径中的GSTM1基因和TFRC基因在成骨细胞的正常分化和废用性OP发病机制过程中起重要作用。这些研究表明各种类型OP的发生可能与成骨细胞中铁稳态失衡和铁死亡有关。

2.2 成骨细胞铁死亡与OP发生发展

通过抑制铁过载和(或)LPO积累可抑制成骨细胞铁死亡,从而改善OP症状的研究表明抑制成骨细胞铁死亡可能在治疗OP中发挥重要作用。例如,Valanezhad等[36]发现Ferrostatin-1(一种肿瘤细胞铁死亡抑制剂)对erastin诱导的MC3T3-E1细胞铁死亡具有抑制作用。线粒体是细胞内氧化还原的重要场所,在铁死亡发生过程中起到十分重要的作用。铁可以通过线粒体外膜和线粒体内膜到达线粒体基质,随后调节线粒体的生理功能[37]。线粒体铁蛋白(mitochondrial ferritin,FtMt)则是一种存在于线粒体内的亚铁氧化酶,其可将铁储存在线粒体中并限制Fe2+和过氧化氢之间发生的芬顿反应,从而降低细胞内氧化应激反应。在生理条件下,FtMt调节线粒体中的游离铁含量,维持正常的线粒体铁代谢。FtMt过表达可以逆转erastin诱导的铁死亡[38]。随后,Wang等[39]发现FtMt过表达通过减少过量Fe2+引起的氧化应激,可减少高糖条件下的成骨细胞铁死亡。Xu等[40]发现维生素D受体激活剂1,25-二羟维生素D3可以通过激活维生素D受体及其下游核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2 related factor 2,Nrf2)/GPX4信号通路,导致脂质过氧化作用下调,从而减弱成骨细胞铁死亡。此外,研究还发现,过表达SIRT6(沉默信息调节蛋白的一种)可以通过抑制地塞米松诱导的成骨细胞铁死亡的发生,保护成骨细胞活性,促进成骨细胞分化[41]。Lu等[42]的研究则发现骨髓来源的内皮祖细胞中提取的细胞外囊泡(extracellular vesicles extracted from bone marrow-derived endothelial progenitor cells,EPC-Evs)增加了类固醇诱导的OP小鼠模型骨小梁骨和骨髓的体积和密度,并通过生物信息学分析出EPCs-EVs能够逆转地塞米松诱导的氧化损伤标志物增加。

随着相关研究的不断展开,已经发现了一些物质可以通过抑制成骨细胞的铁死亡来治疗OP。常见的像褪黑素(whether melatonin,MT),这是一种由脑松果体分泌的激素之一。Ma等[43]研究发现,MT可抑制Nrf2和c-JUN转录因子之间的相互作用,从而降低下游血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)启动子活性。而HO-1可催化血红素氧化释放大量不稳定的游离铁,进而催化芬顿反应形成脂质过氧化物。因此,MT正是通过抑制Nrf2/HO-1信号通路抑制成骨细胞的铁死亡,从而改善体内外骨微结构。Luo等[44]研究发现,Wnt激动剂、铁死亡抑制剂或抗氧化剂MT在铁过载的下游发挥作用,减少ROS和LPO的产生来恢复成骨细胞分化,从而在不减少铁过载的情况下防止铁死亡。此外,一些中草药中含有的物质也被发现具有抗OP的作用。例如,Lin等[45]从知母中分离得到阿拉伯甘露聚糖(PAAP-1B),其由阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖组成。PAAP-1B通过降低4-HNE、MDA、线粒体活性氧化物质水平和脂质过氧化来抑制成骨细胞的铁死亡,并且减轻了糖尿病性OP中SLC7A11和谷胱甘肽表达的下调。另一项研究发现,青娥丸(Qing-e Pill,QEP)可以通过PI3K/AKT通路和ATM通路抑制铁死亡,促进成骨细胞存活,对OP有治疗作用[46]。见图1。

图1 成骨细胞铁死亡的机制及调控Fig.1 Mechanism and regulation of ferroptosis in osteoblasts

3 骨髓间充质干细胞铁死亡与成骨分化

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类具有自我更新及多向分化潜能的干细胞,也是成骨细胞的主要来源。然而,一些研究表明铁和铁蛋白能够特异性抑制BMSCs的成骨定型和分化[47]。Lu等[48]的研究发现,铁调素可以增强BMSCs成骨分化和矿化,表现为分化标志物碱性磷酸酶和成骨基因的上调。Apelin是一种由脂肪细胞分泌的内源性脂肪因子。Chen等[49]发现Apelin可以激活BMSCs的有丝分裂,改善其氧化应激水平,通过AMPK-α的磷酸化促进BMSCs的成骨分化。抗衰老中草药黄芪的主要活性成分黄芪多糖被发现可减弱柠檬酸铁铵诱导的铁过载导致的BMSCs增殖抑制,并且黄芪多糖处理抑制了柠檬酸铁铵处理的BMSCs细胞内和线粒体ROS水平的增加[50]。这些实验的结果表明铁过载和氧化应激可降低BMSCs的增殖活性及成骨分化能力。近期的研究也证实了抑制BMSCs铁死亡可以增强其增殖活性及分化能力。例如,Li等[51]发现MT可以通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路来抑制BMSCs的铁死亡,从而减少类固醇性OP的发生。此外,研究发现槲皮素和生育酚也可通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制BMSCs铁死亡,从而保护BMSCs免受氧化应激损伤,恢复其成骨能力[52-53]。黄杞苷则可通过Nrf2/Keap1抗氧化途径减少BMSCs中ROS以及LPO的积累,减轻氧化损伤,防止铁死亡的发生,并促进BMSCs的成骨分化[54]。依布硒是一种具有谷胱甘肽过氧化物酶样活性的抗氧化剂,可改善脂多糖诱导的BMSCs铁死亡和成骨抑制[55]。近期的一项研究还发现,维生素K2可以减轻高糖引起的BMSCs铁死亡,起到改善2型糖尿病性OP的作用[56]。总的来说,这些研究表明铁死亡会降低BMSCs活性,影响其成骨能力,进而影响骨重建,导致OP的发生。

外泌体是一种微小的细胞外囊泡,其内部包括了特定蛋白、mRNA、microRNA和lncRNA等物质。外泌体可由多种类型的细胞释放,其细胞信息交换在疾病的发生发展中尤为重要。最近的研究表明,BMSCs来源的外泌体(MSCs-derived exosomes,MSC-Exos)及其内含的非编码RNA可能在调控骨相关活性中起到重要作用。例如,研究人员发现MSC-Exos中过表达的microRNA-130a、microRNA-140-3p和miR-129-5p增加了BMSCs的成骨分化并减弱了其成脂分化[57-59]。Zhao等[60]研究发现,MSC-Exos可通过MAPK途径促进成骨细胞增殖,从而改善OP。Yang等[61]发现,MSC-Exos内含的lncRNA-MALAT1通过介导micRNA-34c/SATB2轴增强OP小鼠的成骨细胞活性。Zhang等[62]发现,MSC-Exos携带microRNA-935并通过靶向信号转导及转录激活因子1促进成骨细胞的增殖和分化。近期的一些研究还报导了MSC-Exos中的非编码RNA在心肌细胞、小胶质细胞和肝细胞中通过调控铁死亡的方式,在心血管系统、神经系统以及消化系统疾病的预防和治疗中发挥重要作用[63-65]。综合考虑microRNA可能通过影响成骨细胞的氧化应激水平,从而改变其增殖和分化功能的相关研究[66-67],假想某些MSC-Exos可能通过影响成骨细胞的铁死亡,来发挥抗OP的作用。见表1。

表1 成骨细胞或BMSCs铁死亡的干预措施及其机理Table 1 Intervention measures and mechanism of ferroptosis in osteoblasts or BMSCs

4 展望与总结

铁死亡相关机制目前仍待进一步深入研究,然而随着铁死亡方面研究的不断涌现,已经表明铁死亡在OP的发病机制中发挥重要作用。其中成骨分化中铁死亡的相关研究尤为值得关注。越来越多的研究表明成骨细胞铁死亡可能是影响OP发病机制的重要影响因素。那么如何抑制成骨分化中铁死亡的研究就显得十分重要。目前,一些中草药成分对抑制成骨分化中的铁死亡以及改善OP的作用机制的研究已经部分阐明,这为OP的治疗提供了一些理论依据。此外,一些外泌体中非编码RNA在骨相关细胞铁死亡中发挥着重要作用,这预示着靶向非编码RNA可为OP提供一个新的潜在治疗靶点。本文总结了铁死亡的部分机制,以成骨分化中的铁死亡为切入点,阐明了抑制成骨分化中的铁死亡可能成为OP防治的重要途径,并为后续有关铁死亡与OP的研究提供了思路。