肠道菌群代谢产物氧化三甲胺介导骨质疏松机制研究

元宝华 李兴勇 刘学睿 唐兆鹏 李大娟 刘晓婷 姚兴璋 杨琛 杨博文

1.甘肃中医药大学,甘肃 兰州 730030

2.甘肃省人民医院,甘肃 兰州 730030

3.甘肃省中医院,甘肃 兰州 730030

4.兰州市第一人民医院,甘肃 兰州 730030

肠道菌群(gut microbiome,GM)是人体内最大的生态系统,代表了一个隐藏的宝库,其中包含数万亿种居住在宿主肠上皮屏障中的微生物[1]。在过去的十年中,随着16 S核糖体RNA测序、宏基因组测序技术、代谢组和宏转录组测序等分子工具和技术的进步,宿主-GM之间复杂的相互作用正在逐步被破译,揭示了GM维持许多机体生理功能,包括免疫力、新陈代谢和炎症反应,可以影响人体健康的各个方面[2]。同时GM受到外界的侵扰,微生物组成和代谢能力发生的变化会影响宿主生物学相关分子,对免疫功能、神经调控和疾病进展产生深远的影响。然而,与人类基因组的稳定性相比,肠道微生物群的可塑性使其成为个体化治疗的有希望的机会。

骨质疏松症(osteoporosis,OP)作为一种全身性骨代谢疾病,与社会人口老龄化密切相关,以骨密度降低、骨微结构破坏和脆性骨折发生风险增加为主要特征,已成为全球主要公共卫生问题之一[3]。目前OP的治疗策略主要集中在抗骨质溶解(如雌激素、双膦酸盐)和合成代谢药物(如特立帕肽、阿巴帕肽)上,上述药物由于副作用大且缺乏长期疗效的证据,因此这类药物的治疗方案存在一些局限性[4],而“肠骨”轴理论证明了GM及其代谢产物有希望成为治疗OP新的选择,并且有很大的潜力和价值。

GM衍生代谢产物的种类和数量众多,GM衍生代谢产物不仅影响遗传和表观遗传调控,还影响免疫细胞的新陈代谢,包括免疫抑制和炎症细胞[5]。氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide,TMAO)是一种重要的GM衍生代谢产物,又称为三甲胺-N-氧化物(化学结构式见图1)[6],食物中的胆碱、甜菜碱和左旋肉碱等物质在肠道菌群的作用下转化为三甲胺(Trimethylamine,TMA),TMA极易被肠道上皮细胞吸收,通过门静脉循环被转运至肝脏并被黄素单加氧酶家族(flavin-containing mono-oxygenase,FMO)氧化,其中黄素单加氧酶3(flavin-containing mono-oxygenase 3,FMO3)在整个氧化过程中起主要作用,使TMA氧化为三甲胺-N-氧化物(trimethylamine N-oxide,TMAO)[7]。TMAO在心脑血管疾病中被认为是评估为不良心血管事件生物标志物之一[8],在阿尔茨海默氏症、糖尿病、肾脏疾病、代谢功能障碍相关性脂肪肝、前列腺癌以及肥胖等疾病的发展扮演了重要角色[9],同时最新研究发现TMAO在OP的发生与发展发挥了重要作用,本文就TMAO促进OP的作用机制及药物干预的研究进展做一综述,探究TMAO作为OP的生物标志物及潜在治疗靶点的可行性。

图1 三甲胺-N-氧化物化学结构式Fig.1 Chemical structural formula of trimethylamine N-oxide

1 TMAO和OP的关系

TMAO是一种关键的GM衍生代谢物,血浆TMAO升高致使促炎细胞因子增加,最终导致多种炎症相关疾病,包括OP、心血管疾病、糖尿病、脑卒中和代谢综合征[10]。根据现有报道,TMAO主要从氧化应激(oxidative stress,OS)、NF-κB信号通路、NLRP3炎症小体、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)等方面来介导促进OP,加速OP的病程进展[11]。TMAO通过促进OS激活炎症通路,进而促进破骨细胞(osteoclast,OC)的形成导致骨量流失加重。另一方面TMAO激活炎症通路导致BMSCs成脂分化比例增多并抑制BMSCs成骨分化,使成骨细胞(osteoblast,OB)的分化减少,骨形成的量大幅度降低,继而导致OP的发生与加重,同时OP相对特殊的内环境会加速一些炎症因子的生成与释放,反过来促进OP的进展,形成一个循环。因此TMAO对于OP病程具有显著推进作用,并且主要是以炎症反应为作用渠道。

1.1 TMAO诱导活性氧促进并加重OS

活性氧(reactive oxygen species,ROS)引发的OS介导了多条关于OP形成的通路,在OP的整个进程中扮演了重要角色[12]。TMAO可以抑制 SIRT3-SOD2信号通路促使线粒体ROS(mtROS)的产生[13],SIRT3-SOD2信号通路对于调节mtROS产生至关重要,SIRT3通过脱乙酰激活线粒体超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 2,SOD2),并将超氧自由基转化为无害的氧[14]。TMAO诱导过量的ROS产生并导致OS,TMAO还可通过上调尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NADPH oxidase 4,NOX4)和下调SOD2来加重OS[15]。过量的ROS积累会使天然抗氧化防御机制引起的氧化还原稳态失衡,继而阻碍成骨细胞的形成,从而导致骨吸收相对增加,从而导致OP的发生[16]。同时mtROS的大量累计会导致信号改变、膜损伤、细胞色素c的释放以及线粒体蛋白质和DNA的氧化损伤,引起线粒体凋亡并促进ROS的产生,引起OB凋亡造成骨量丢失,促进OP的发生和病程进展[17]。

1.2 TMAO激活NF-κB信号通路和NLRP3炎症小体

TMAO会导致ROS在机体过量积累,ROS是核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体被激活的已知机制之一,其中mtROS的形成对于NLRP3激活尤其重要[18]。NLRP3炎症小体活化后致使白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)的生成增加,IL-1β作为骨吸收的强刺激剂,与巨噬细胞的受体结合并促进核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for NF-KappaB,RANKL)的产生,RANKL与OC前体细胞上的受体活化因子(receptor activator of NF-KappaB,RANK)结合,导致破骨细胞活化[19]。在下颌骨缺损模型小鼠的研究中发现,NLRP3缺乏可以显著促进成骨细胞分化并加速下颌骨愈合[20]。NLRP3炎症小体广泛参与OC形成及骨吸收的过程,NLRP3炎症小体被激活之后会持续刺激体内OC分化,导致骨吸收升高和随后的骨质流失[21]。

TMAO升高和随后的OS会进一步抑制组蛋白去乙酰化酶6(sirtuin 6,Sirt6)表达,研究发现骨髓Sirt6缺乏会促进卵巢切除术诱导的小鼠加快衰老和松质骨质流失,Sirt6缺乏会激活NF-κB和组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)促进小鼠破骨形成并抑制成骨细胞的生成[22]。NF-κB是一种转录因子,涉及固有免疫和适应性免疫的多种功能,可作为炎症和骨重塑的主要调节因子,而持续的慢性炎症和ROS水平升高也会增强NF-κB活性。研究发现在NF-κB信号传导缺陷的转基因小鼠中观察到过量的骨形成,表明NF-κB在骨形成和重塑中起着重要作用[23]。NF-κB被OS以及其他细胞因子激活后继而促进肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等相关炎症过度表达,TNF-α与TNF-α受体(TNFR)结合后,促使RANKL分泌增多,促进OC的增殖与分化,TNFα也可以通过Smad或Smad非依赖机制抑制骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)诱导的OB分化,TNF-α还可以刺激OC分泌IL-6,IL-6进而促进OC前体的分化与成熟,从而促进骨吸收[24]。TNF-α也可以激活NF-κB通路加速骨质的流失,形成一个骨量丢失的恶性循环。

TMAO和后续的OS可以激活NLRP3炎症小体和NF-κB信号通路,促进OC分化,导致骨质流失,最终引发OP[25]。

1.3 TMAO降低BMSCs的分化能力

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种广泛存在于骨髓腔中的干细胞,具有分化成多个细胞谱系的能力,包括OB、脂肪细胞、成纤维细胞和软骨细胞,并且BMSCs的分化过程受多种分子通路的调控,BMSCs在成骨性疾病的干细胞治疗中显示出良好的潜力[26]。BMSCs的成骨和脂肪形成之间的平衡在维持骨稳态方面起着至关重要的作用,并且是OP发展的决定因素[27]。研究表明骨质疏松性的BMSCs内在信号具有不同程度的缺陷,导致其正常分化功能改变,成骨分化能力差,并有利于脂肪生成增加[28]。Lin等[11]研究发现,TMAO水平与骨密度(bone mineral density,BMD)值呈显著负相关,TMAO可诱导和促进BMSCs的成脂分化,并抑制BMSCs的成骨分化。同时,成脂分化标志蛋白过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARγ)和CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBP-α)的表达上调,成骨分化蛋白Runt相关转录因子2 (runt-related transcription factor 2,Runx 2)蛋白和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达下调,在经过TMAO处理后的BMSCs细胞增殖显著降低,促炎细胞因子水平(IL-1β、TNF-α、IL-6)显著增加。另一项TMAO处理BMSCs的实验研究结果表明,TMAO可以明显促进BMSCs的成脂分化同时提高ROS浓度水平和活性,并且使IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎细胞因子大量产生,抑制BMSCs的成骨分化,导致骨代谢失衡,加重骨量丢失,进而导致或加重OP发生和进程[29]。

TMAO可以干预BMSCs的成骨分化能力,使骨量生成减少,继而骨量吸收-增加的平衡被打破,总体骨量出现减少,导致OP的出现并时期进程加快。见图2。

图2 TMAO生成途径和TMAO介导OP路径示意图Fig.2 Schematic diagram of TMAO generation pathway and TMAO mediated OP pathway

2 小结

TMAO对于OP的发生和发展有直接关联,主要通过介导OS、NF-κB信号通路、NLRP3炎症小体和BMSCs等方面来促进OP,但大部分GM衍生代谢产物是通过多渠道、多阶段及多步骤介导机体相关生理病理过程,因此TMAO不单独通过炎症相关通路介导OP,其他信号通路(如自噬信号通路)也可能参与其中,同时TMAO抑制BMSCs成骨分化的具体机制过程也不明确,这些内容还需要在相关研究中进一步去验证。

TMAO作为心血管不良疾病的生物标志物之一,其临床检测方式已经成熟且结果快速准确,并且TMAO和OP因果关系已经明确,因此TMAO作为OP的观测指标是十分合理的,能够方便快捷地检测临床这一指标更具有推广研究的实际意义。随着关于TMAO和OP的作用机制被逐步揭示,未来其已有望成为OP的生物标志物之一。药物干预TMAO治疗OP的研究目前较少,但根据已有的研究结果表明药物干预TMAO治疗OP是有效的[30-32]。然而目前这方面的研究开展的较少,还需要等多相关研究来支持丰富上述结论。因此将TMAO作为OP治疗靶点的观点还有待商榷,但其有望在未来成为OP新的治疗靶点,从而为OP的新药研发和治疗方案提供新的方向和理论支持。