帕瑞昔布钠改善腹腔镜下直肠癌根治术患者的炎症微环境并促进患者恢复：基于下调CXCL8-CXCR1/2表达

武若杰，刘 睿，张一粟，李晓红

蚌埠医学院第一附属医院麻醉科，安徽 蚌埠233000

结直肠癌（CRC）是我国消化道中常见的恶性肿瘤之一，截止2022年数据显示结直肠癌发病率居恶性肿瘤第2位，病死率居恶性肿瘤第4位，中国结直肠癌的发病率和死亡率显著增加［1］。肿瘤转移是患者死亡的主要原因之一，是一个涉及多因素的复杂过程［2］。研究发现转移发生的前源是原发部位肿瘤或转移部位的循环肿瘤细胞（CTC）［3］。CTC与肿瘤微环境（TME）有密不可分的关系，TME促成了CTC的发生和演变［4］。TME是指肿瘤或癌症干细胞所处的细胞环境，其组成的标志性特征包括免疫细胞、基质细胞、血管及细胞外基质［5］。TME对肿瘤原发部位的进展和侵袭产生影响，对肿瘤转移具有一定的促进作用［6］。

多项研究均探讨了TME与转移的关系［7,8］，趋化因子及其受体广泛表达于多种类型肿瘤细胞中，能够对肿瘤的发展和侵袭产生影响［9］。CXCL 8作为肿瘤相关中性粒细胞的趋化剂，在TME中促进血管形成，为肿瘤生长转移提供基础［10］。CXCL8-CXCR1/2 轴可以干扰TME中的细胞分化与功能，最终在肿瘤微环境中对癌症的增殖、血管分化、侵入和转移有不同的影响［11-13］。

帕瑞昔布钠是一类非甾体类抗炎药物，主要通过降低环加氧酶-2（COX-2）来减少中枢和外周的前列素生成，从而抑制炎症介质的产生与炎症反应［14］。帕瑞昔布钠对围术期肿瘤患者的影响作用，主要表现在减轻术后疼痛、抑制炎症反应［15］、保护免疫功能，抑制肿瘤复发［16］；但是帕瑞昔布钠对腹腔镜下直肠癌根治术患者TME中CXCL8-CXCR1/2轴影响尚未见报道。本研究通过观察帕瑞昔布钠对腹腔镜下直肠癌根治术患者围术期CXCL8，CXCR1，CXCR2 的影响，明确帕瑞昔布钠对在围术期TME的调控作用及机制。

1 资料和方法

1.1 研究对象

2022年7月～2023年2月共60例患者纳入了试验，均为同一组胃肠外科医生治疗的腹腔镜下直肠癌根治术（采用Miles术式）患者。采用随机数字表法分为对照组、试验组，每组30例。本研究获得蚌埠医学院第一附属医院伦理委员会的批准（伦理批号：2023YJS213）。

1.1.1 诊断标准 参照《结直肠癌诊疗规范（2020 年版）》，所有入组病例均已进行结肠镜、腹部盆腔及双肺增强CT、核磁共振成像及病理检查确诊为直肠癌。

1.1.2 纳入标准 美国麻醉医师协会（ASA）分级Ⅰ级～Ⅲ级；年龄40～64岁，不限制性别；入组患者体质量指数（BMI）：20～30 kg/m2；患者和（或）其授权委托人知情本研究涉及药物及其风险后，同意并签署本研究知情同意书。

1.1.3 排除标准 患者合并其他脏器（如心、脑、肝、肾等）严重病变或者与手术相关禁忌证；患者直肠癌已发生临床远处转移；经过免疫抑制剂、放疗及新辅助化疗的患者；患有其他肿瘤疾病史和（或）已经加入其他任何类型研究；对帕瑞昔布钠过敏或依从性差的患者。

1.2 试剂

人白细胞介素-8（CXCL 8）ELISA 试剂盒（上海磐超生物科技有限公司）；人白细胞介素-6（IL-6）ELISA试剂盒（上海磐超生物科技有限公司）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（上海磐超生物科技有限公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）、DMEM 培养基、RPIM 1640 培养基、胎牛血清（FBS），胰酶（碧云天生物技术研究所）；电泳液（天地人和/MOPS Running Buffer(1L)/B23 021405；转膜液（Y-Tec快速转膜液20x/YWT0500）；脱脂奶粉（BD Difco/1053907）；BCA 蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术研究所）；PVDF 膜（Bioshrap）；鼠抗人CXCL8单克隆抗体、鼠抗人CXCR1，CXCR2 单克隆抗体、辣根过氧化酶标记山羊抗鼠免疫球蛋白（Ig）G、兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体、山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（Affinity）；ECL 化学发光试剂盒，RIPA裂解液（北京康为世纪生物科技有限公司）；DAB 显色试剂盒，即用型SABC（小鼠抗兔IgG）试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 分组处理

采用双盲、前瞻性、随机对照的研究方法，以1∶1进行随机对照研究，采用随机数字表法将60例患者随机分为2组（每组30人）：对照组（A组）和试验组（B组），均实施全身麻醉，试验组分别于全身麻醉诱导开始时（T1）、术后即刻（T2）、术后12 h（T3），将帕瑞昔布钠40 mg融入20 mL 生理盐水中稀释后缓慢静脉注射；对照组以同方法给予等容量生理盐水。

1.4 麻醉方法

1.4.1 麻醉前访视 所有患者术前常规禁食8 h、禁饮4 h及肠道准备，无术前用药。

1.4.2 术中麻醉管理 入室后，核对患者信息进行外周静脉开放，监测ECG、SpO2、BP和BIS麻醉深度。患者通过改良Allen 试验后，进行桡动脉穿刺置管并在术中持续监测血压。麻醉诱导：咪达唑仑注射液0.02～0.05 mg/kg，枸橼酸舒芬太尼注射液0.25～0.5 μg/kg，依托咪酯0.2～0.4 mg/kg，顺式阿曲库铵0.2～0.3 mg/kg，3 min后插入气管导管，连接呼吸机，调节呼吸参数（呼吸频率12～16次/min，潮气量8～10 mL/kg、吸呼比1∶2，PetCO2维持在35～45 mmHg，氧流量1.0～2.0 L/min）。麻醉维持：采用吸入1%～2%七氟醚、泵注丙泊酚4～8 mg/（kg·h）、瑞芬太尼0.4～0.7 μg/（kg·h）、顺式阿曲库铵0.1 mg/（kg·h），BIS维持在40～60。B组分别于全身麻醉诱导开始时（T1）、术后即刻（T2）、术后12 h（T3）给予帕瑞昔布钠40 mg融入20 mL 生理盐水中稀释后缓慢静脉注射，A组以同方法给予等容量生理药水。

1.4.3 术后镇痛管理 镇痛泵配比方案：100 μg枸橼酸舒芬太尼注射液和5 mg盐酸托烷司琼注射液，用生理盐水稀释到100 mL。参数：单次脉冲式输注2 mL药液，连续输注速度1.5 mL/h，自动锁定时间30 min。镇痛泵在术后48 h后回收。

1.5 观察指标

1.5.1 主要观察指标 ELISA测定血浆中炎症因子IL-6，TNF-α，CXCL8 的含量取患者于T1、T2、T3、T4的外周静脉血用于ELISA检测。严格按试剂盒说明书的操作进行。

Ficoll-Hypaque 密度梯度分离法分离人外周血单个核细胞分离过程在室温下进行，在15 mL离心管中含Ficoll-Hypaque 分离液3 mL，取血样标本3 mL与等量生理盐水3 mL混合吹打均匀，将此混合液加入Ficoll-Hypaque 分离液的液面上，2000 r/min离心20 min。离心后可见离心管内大致分3 层，在上、中层界面处有一白色云雾带(以外周单个核细胞为主)，轻柔吸取云雾层，收集外周单个核细胞层。利用生理盐水洗细胞2 次，置于15 mL离心管中，加入5倍以上生理盐水，10 000 r/min离心1 min，收集沉淀细胞，用RPMI 1640 完全培养液稀释至悬浮细胞至1×106个/mL。

Western blot 检测外周单个核细胞（PBMCs）中CXCL8，CXCR1和CXCR2 蛋白表达和含量，提取蛋白质过程中，使用RIPA 细胞裂解缓冲液裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min离心15 min，提取细胞总蛋白后利用BCA法测量计算，5 倍SDS 上样缓冲液与100 μg蛋白质按比例混合，100 ℃水浴加热5 min，用10%经凝胶电泳分离后转膜，后用5%脱脂奶粉封闭2 h；按说明书用一抗4 ℃孵育过夜；用二抗37 ℃轻摇，室温孵育2 h，将洗膜晾干后加入ECL工作液显色，曝光、显影。用Biorad Image Lab 图像分析系统，分析各条带的灰度值并记录。

1.5.2 其他观察指标 术前两组患者的一般基线资料，包括：年龄、术前ASA分级、术前既往史等信息；术中资料包括：手术时长、麻醉用药和镇痛药的使用量；术后资料包括：在术后12 h、术后24 h时刻患者的VAS评分，术后胃肠道不良反应、随访资料。随访时间为6个月，依据患者手术后时间进行术后检查，肿瘤发生发展的结果依据复查的影像学检查定性为转移或者复发。

1.6 统计学分析

采用SPSS 20.0 统计软件处理，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用成组t检验，组内比较采用重复测量的方差分析。使用GraphPad Prism9.0 进行数据分析验证和作图。Ρ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的临床资料及术中资料比较

两组患者在年龄、性别、术前已确诊合并症、ASA分级、患者术中静脉麻醉药用量、镇痛药物用量的差异均无统计学意义（Ρ＞0.05，表1）。

2.2 两组患者的炎症指标含量比较

与对照组比较，术后即刻、术后12 h 和术后24 h试验组血浆中IL-6、TNF-α、CXCL 8含量均明显减少（Ρ＜0.05，图1）。

图1 两组患者不同时间点血浆白介素-8(A)、白介素-6(B)及肿瘤坏死因子-α(C)水平比较Fig.1 Comparison of plasma interleukin-8(A),interleukin-6(B) and tumor necrosis factor-α (C) levels at different time points between the two groups (Mean ± SD).Group A:Control group;Group B: Experimental group;T1: Before operation.T2: Immediately after operation;T3: 12 h after operation;T4: 24 h after operation.*P＜0.05,**P＜0.01 vs GroupA.

2.3 两组患者PBMCs中CXCL 8、CXCR1和CXCR2蛋白表达水平的比较

与术前时刻相比，CXCL 8、CXCR1和CXCR2蛋白表达量处于上升阶段（Ρ＜0.05）；于术后即刻、术后12 h、术后24 h试验组蛋白表达的上调程度较对照组上调程度均明显降低（Ρ＜0.05，图2），CXCR2 表达的上调程度明显较CXCR1 上调程度低。

图2 帕瑞昔布钠对两组患者PBMCs中CXCL8,CXCR1,CXCR2蛋白表达量的影响Fig.2 Effect of parecoxibuna on CXCL8,CXCR1,and CXCR2 protein expressions in PBMCs in the two groups.A:Protein expressions of CXCL-8,CXCR-1 and CXCR-2 determined by Western blotting.B-D:Quantitative analysis of protein expressions relative to GAPDH.Group A: Control group;Group B: Experimental group;T1: Before operation.T2:Immediately after operation;T3:12 h after operation;T4:24 h after operation.*P＜0.05,**P＜0.01 vs GroupA.

2.4 两组患者术后VAS评分比较

与对照组比较，术后12 h和术后24 h试验组患者术后VAS评分均明显减少（Ρ＜0.05），但在术后即刻两组患者VAS评分无明显差异（Ρ＞0.05，图3）。

图3 两组患者围术期各时间点VAS评分的比较Fig.3 Comparison of VAS scores at different perioperative time points between the two groups.T1: Before operation.T2: Immediately after operation;T3: 12 h after operation;T4: 24 h after operation.*P＜0.05 vs GroupA.

2.5 术后资料比较

B组应用帕瑞昔布钠的患者术后住院时长较A组更短，差异有统计学意义（Ρ＜0.05，表2）。两组患者在术后胃肠道术后并发症方面比较，差异有统计学意义（Ρ＜0.05，表2）。对两组患者术后6个月随访发生肿瘤转移人数统计，对照组较试验组多，但差异无统计学意义（Ρ＞0.05）。

表2 两组患者术后数据比较Tab.3 Comparison of postoperative data between the two groups

3 讨论

本试验主要研究帕瑞昔布钠对腹腔镜下直肠癌根治术患者围术期TME 影响及作用机制。研究结果表明，应用帕瑞昔布钠能够下调腹腔镜下直肠癌根治术患者炎症指标、减轻术后疼痛、减少术后胃肠道不良反应减少住院时长，其对患者围术期TME产生影响的作用机制可能与下调CXCL8-CXCR1/2表达有关。

在TME中，癌症干细胞、调节免疫细胞、基质细胞等之间相互作用，积极重新配置TME成分进而实现肿瘤稳态［17］。趋化因子是一种拥有复杂结构的小分泌蛋白，在TME中由不同的肿瘤细胞和基质细胞表达并产生影响［18］。趋化因子在炎症和免疫过程中起着至关重要的作用［19］。CXCL8 是提取自人外周单个核细胞（PBMCs）的可作为关键的多功能趋化因子，调节肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移，作为患癌患者的免疫抑制成分，导致患者预后不良［20］。研究证明IL-6、CXCL 8在介导先天免疫反应的细胞中起主要作用，在转移性定植中发挥关键性作用［21］。本研究经ELISA 测定两组腹腔镜下直肠癌根治患者血浆中IL-6、TNF-α、CXCL 8含量，发现应用帕瑞昔布钠的试验组较对照组的炎症因子含量均显著降低，证明帕瑞昔布钠可以很好的抑制腹腔镜下直肠癌根治术患者围术期炎症因子的释放。本研究中应用帕瑞昔布钠的试验组较对照组对降低术后CXCL 8的含量有显著效果，而通过降低术后机体产生的CXCL 8能够对围术期TME乃至患者临床结果产生影响。有研究证明CXCL8上调会促进结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和血管生成，对TME稳态产生影响［22］。

本研究发现，试验组术后12、24 h的VAS评分均显著低于对照组。说明帕瑞昔布钠能更好的减轻患者术后疼痛，从而有效的阻止了术后炎症细胞动员和炎症因子爆发，降低患者术后应激反应。帕瑞昔布钠作内首选的非肠外选择性COX-2抑制剂，有可降低血小板聚集和减轻胃肠功能不良反应的优点［23］。结合本研究对两组患者术后胃肠道不良反应统计，可见试验组较对照组能明显降低腹腔镜下直肠癌根治术患者术后的胃肠道不良反应。帕瑞昔布钠可通过下调促炎因子水平，而上调抗炎因子水平达到减轻肠道损伤的目的［24］。在本研究中应用帕瑞昔布钠可明显减少患者术后炎症因子同时减少术后疼痛，从而共同作用达到促进患者术后胃肠道功能恢复作用。试验组患者的住院时间明显低于对照组，证实应用帕瑞昔布钠能减轻腹腔镜下直肠癌根治术患者手术创伤带来的不良反应，促进患者术后恢复。而有研究证明肿瘤微环境促进COX 2表达的增加，为肿瘤发生发展提供迁移和侵袭的可能［25］。帕瑞昔布钠的应用一定程度上可改善淋巴细胞亚群和NK细胞亚群的免疫功能，并延缓肿瘤的复发［26］。结合以上及本研究结果证实了帕瑞昔布钠通过降低腹腔镜下直肠癌根治术患者术后产生的炎症反应，减轻术后疼痛，从而加速术后免疫功能恢复、改善围术期肿瘤微环境变化。

CXCL8-CXCR1/2轴已证实在诱导肿瘤细胞进展和TME重塑中产生重要促进作用［27］。研究利用Western blot 分别检测腹腔镜下直肠癌根治术患者围术期外周单个核细胞（PBMCs）中CXCL8，CXCR1/CXCR2 蛋白表达和含量，数据结果上看出，试验组CXCL8，CXCR1和CXCR2 蛋白表达水平的上调程度较对照组蛋白上调程度在术后即刻、术后12 h、术后24 h均显著降低，说明帕瑞昔布钠通过下调腹腔镜下直肠癌根治术患者围术期外周单个核细胞（PBMCs）中趋化因子配体CXCL8及受体CXCR1/CXCR2 的表达，在研究中证实利用下调CXCL 8-CXCR1/2表达能阻止肿瘤干细胞异质性，同时发现CXCR1表达与淋巴结转移之间存在显着关联［28］。在以上报道中可证实，下调CXCL8-CXCR1/2轴的表达是能够对肿瘤的发生发展产生影响的并能够作用TME。国外一项研究也证明使用新型动物模型的数据，CXCL 8/CXCR2在TME中的表达在结肠癌生长，进展和转移中起着关键作用［29］。结合研究中直肠癌患者术后疼痛减轻、术后胃肠道功能恢复加快及住院时长减少的结果，帕瑞昔布钠可能是通过减少趋化因子CXCL 8配体与受体的量，使得炎细胞在肿瘤微环境的过度趋化减轻，从而能进一步减轻炎细胞乃至患者术后的氧化应激及减轻术后疼痛而得以对围术期肿瘤微环境产生一定影响，同时对趋化因子产生影响进而对患者围术期免疫功能产生作用。近期最新研究证实，帕瑞昔布钠可通过抑制人结直肠癌连环白量的下调来抑制EMT和转移，从而达到抗肿瘤转移的作用［30］。结合本研究两组患者术后6个月随访的肿瘤发生发展情况，对照组发生转移患者数目是多于试验组。帕瑞昔布钠可通过减少围术期趋化因子配体和受体的量从而改善趋化因子对围术期肿瘤微环境所带来的不利影响，维持TME稳态。

本研究存在一些局限性。首先，我们只是对术后24 h内进行了评估和观察，可观察到炎症水平在术后24 h逐渐达到高峰，术后3～7 d或更久可能观察到围术期的炎症水平改变、免疫抑制现象、胃肠道不良反应的发生。同时随访时间仅仅在术后6个月内，对患者肿瘤发生发展无法准确评估，随访时间在3～5年可能获得更准确的结果。再者，本文研究的仅是在血液中趋化因子指标而并未对肿瘤局部部位的趋化因子及TME细胞组成进行研究，因此本研究的统计效力有限需要更多时间并进一步对肿瘤组织局部炎症产生和炎细胞趋化进行研究，后续需要在细胞及作用位点方面继续研究。

综上所述，帕瑞昔布钠能显著降低腹腔镜下直肠癌根治术患者术后血浆中炎症因子、炎症指标，减轻术后疼痛，减少胃肠道术后不良反应进而促进患者术后胃肠道恢复，减少住院时间。帕瑞昔布钠能够减慢腹腔镜下直肠癌根治术患者肿瘤转移，改善围术期肿瘤微环境稳态，其机制可能与下调CXCL8、CXCR1 和CXCR2 蛋白表达，减少IL-6、TNF-α、CXCL 8的合成与分泌，减弱患者围术期肿瘤微环境中炎细胞的趋化反应，减轻术后疼痛及围术期炎症应激反应有关。