植物乳杆菌固体发酵对复方中药中有效成分含量的影响

侯楠楠，谢全喜*，王俊贤，王 倩，王 梅，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司 山东省动物微生态制剂重点实验室，山东 泰安 271000）

近年来我国畜牧业得到快速发展，广大农牧科技人员在开发利用中草药资源、促进农牧业发展方面，取得了一定成果[1]。2013年，农业部修订的《饲料原料目录》将115种中草药列入饲用植物原料目录。2020年我国规定，退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种。因此，开发中草药饲料添加剂替代抗生素成为行业研究的热点。

我国是中药生产大国，但随着中药材在人体及动物体上的广泛应用，中药也出现供不应求现象[2]。发酵是中药传统炮制工艺之一，工艺简单，发酵中药性质稳定，不易产生抗药性，避免了原料的浪费，提高了中药的利用率，可作为药食同源的饲料添加剂，是防治动物疾病、替代抗生素的理想选择[3-4]。王福刚[5]研究发现，日粮中添加5%复合益生菌培养物可以显著提高肉羊生长性能、血液中免疫球蛋白含量以及抗氧化活性。史洪涛等[6]研究发现，口服0.2%液体发酵中药蛋鸡的过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）活性均显著高于对照组（P＜0.05）。益生菌发酵中药可以使益生菌和中药协同增效，如李继开等[7]研究发现，利用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对黄芪、绞股蓝、马齿苋3种中药构成的组方进行液体发酵，可显著提高中药粗多糖的含量。耿江苏[8]研究发现，使用益生菌发酵鱼腥草等中药，可提高中药益生菌数量至5.68×108CFU/mL。但中药成分错综复杂，目前研究比较多的主要是液体发酵，关于固体发酵中药作为饲料添加剂的报道比较少。

本研究使用3种植物乳杆菌对黄芪、甘草和益母草等复方中药进行固体发酵，研究其对复方中药微生物和有效成分的影响，以期为中药原料作为饲料添加剂提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料与菌株

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0015、BLCC2-0126和BLCC2-0410：山东宝来利来生物工程股份有限公司菌种保藏中心；黄芪、茯苓、益母草、甘草和当归：泰安永春堂药店。

1.1.2 试剂

乳酸、阿魏酸、芦丁等标准品（纯度均＞98%）：上海源叶生物科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基MRS肉汤培养基、LBS培养基、伊红美蓝培养基、孟加拉红培养基：青岛海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、InertSustain AQ-C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）：日本岛津公司；AL204电子分析天平：瑞士梅特勒托利多有限公司；GL21M高速冷冻离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；CLDC271509超纯水净化系统（超纯水仪）：重庆潺林热能设备有限公司；PHS-3C雷磁精密酸碱度计：上海精密科学仪器有限公司；SB120D超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳杆菌发酵液的制备

将4 ℃保存的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0015、BLCC2-0126和BLCC2-0410斜面活化，转接至装有100 mL MRS液体培养基的盐水瓶中，37 ℃静置培养24 h，活菌数均≥109CFU/mL，备用。

1.3.2 植物乳杆菌固体发酵复方中药

选择甘草、黄芪、茯苓、益母草和当归五味中药，按质量比4∶2∶2∶2∶1进行充分混合。按复方中药、麸皮和豆粕质量比为7∶2∶1配制基料。称取一定质量的基料，按照基料与水比为1.0∶0.5（g∶mL）配制好发酵底物，按100 g/袋进行装袋，每个处理设3个平行。分别按2.0%的接种量接入培养好的植物乳杆菌发酵液，以不接种任何菌株的空白料为对照组，压实后于37 ℃培养箱进行生料厌氧发酵，分别于发酵24 h、48 h和72 h取样，测定pH值、微生物含量、总酸含量、有机酸含量、甘草酸、粗多糖、总黄酮、阿魏酸和甘草次酸含量。

1.3.3 检测方法

pH值：准确称取10.00 g样品加入90 mL灭菌后的生理盐水中，搅拌均匀后静置10 min用玻璃电极pHS-3C型pH计测定。

微生物含量：准确称取10.00 g样品加入90 mL带有玻璃珠的无菌生理盐水中，振荡均匀，采用10倍梯度稀释法稀释，取适当稀释度的样品分别涂布于LBS培养基、孟加拉红培养基和伊红美兰培养基中，分别于37 ℃、30 ℃和37 ℃培养48 h、48 h和24 h。乳杆菌参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》进行菌落计数；霉菌参照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》进行菌落计数；大肠杆菌（Escherichia coli）参照GB 4789.38—2012《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数》进行菌落计数。根据菌落数计算发酵中药中乳杆菌、霉菌和大肠杆菌的活菌数，结果用CFU/g表示。

总酸含量：参照国标GB/T 12456—2021《食品中总酸的测定》，采用酸碱滴定法测定。

有机酸含量：参照国标GB 5009.157—2016《食品安全国家标准食品中有机酸的测定》，采用高效液相色谱法测定。

粗多糖含量：参照牛晓方等[9]的方法，以葡萄糖质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制葡萄糖标准工作曲线，得到葡萄糖标准曲线回归方程为y=0.010 3x-0.002 3（相关系数R2=0.999），根据标准曲线回归方程计算粗多糖含量。

总黄酮含量：参照GB/T 20574—2006《蜂胶中总黄酮含量的测定方法分光光度比色法》检测，以芦丁对照品的质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，得到芦丁标准曲线回归方程为y=13x-0.000 6（相关系数R2=0.996 7），根据标准曲线回归方程计算总黄酮含量。

甘草酸、甘草次酸含量：参照SN/T3854—2014《出口食品中天然甜味剂甜菊糖苷、甜菊双糖苷、甘草酸、甘草次酸的测定高效液相色谱法》测定。阿魏酸含量：参照团体标准T/SHRH025—2019《化妆品中阿魏酸含量的测定》测定。

1.3.4 数据处理

试验数据用Excel 2016软件进行初步处理后，采用SPSS 22.0软件进行统计分析，采用One-way ANOVA进行方差分析，最小显著差别（least significant difference，LSD）法进行组间多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌发酵对复方中药pH值和微生物数量的影响

植物乳杆菌发酵对复方中药pH值和微生物数量的影响见表1。由表1可知，与对照组相比，实验组均可显著降低发酵复方中药pH值（P＜0.05），发酵72 h时均降至4.50以下，实验组间差异不显著（P＞0.05）。实验组均可显著提高发酵复方中药的乳杆菌数量（P＜0.05），发酵24h、48h和72h时，实验组的乳杆菌数量均可达到109CFU/g。发酵过程中，对照组大肠杆菌活菌数呈增加趋势，发酵72 h时达到（1.13±0.20）×103CFU/g，而实验组均未检出大肠杆菌；对照组霉菌活菌数呈增加趋势，发酵72 h时达到（5.61±0.23）×103CFU/g，而植物乳杆菌BLCC2-0015发酵复方中药的霉菌活菌数呈下降趋势，发酵72 h时低于100 CFU/g，植物乳杆菌BLCC2-0126和BLCC2-0410发酵复方中药均未检出霉菌。结果表明，植物乳杆菌发酵可提高复方中药的乳杆菌活菌数，降低大肠杆菌及霉菌活菌数，且植物乳杆菌BLCC2-0126效果最好，其次为植物乳杆菌BLCC2-0410。耿江苏[8]研究证实，使用益生菌发酵鱼腥草等中药，可提高中药益生菌数量至5.68×108CFU/mL，4 ℃保存一个月后活菌数为4.80×108CFU/mL，显微镜检查无杂菌污染，与本试验结果一致。

表1 植物乳杆菌发酵对复方中药pH值和微生物数量的影响Table 1 Effects of Lactobacillus plantarum fermentation on pH and microbial number of compound Chinese medicine

2.2 植物乳杆菌发酵对复方中药总酸和机酸含量的影响

植物乳杆菌发酵对复方中药总酸及有机酸含量的影响分别见表2和表3。

表2 植物乳杆菌发酵对复方中药总酸含量的影响Table 2 Effects of Lactobacillus plantarum fermentation on total acid contents of compound Chinese medicine g/kg

表3 植物乳杆菌发酵对复方中药有机酸含量的影响Table 3 Effect of Lactobacillus plantarum fermentation on organic acid contents of compound Chinese medicine g/kg

由表2可知，与对照组相比，实验组均可显著提高总酸含量（P＜0.05），其中，植物乳杆菌BLCC2-0410发酵复方中药中总酸含量最高，其次为植物乳杆菌BLCC2-0126发酵复方中药，且均显著高于植物乳杆菌BLCC2-0015发酵复方中药（P＜0.05）。植物乳杆菌BLCC2-0410发酵复方中药72 h时总酸含量达到（27.82±1.22）g/kg。结果表明，植物乳杆菌发酵可以显著提高复方中药中的总酸含量，且植物乳杆菌BLCC2-0410提高效果最好，其次为BLCC2-0126。亓秀晔等[10]研究发现，植物乳杆菌发酵猪全价料，总酸含量可达到20.68 g/kg，与本试验结果一致。

有机酸是乳酸菌发酵饲料提高饲料风味的重要指标，能够改善中药气味和口感辛辣刺鼻等动物适口性的问题，其含量的多少与发酵程度密切相关[11]。吴锦兰等[12]研究发现，在乳酸菌LB-1-23接种量2.6%、pH值5.5、发酵温度32 ℃条件下发酵30 h，乳酸产量达到12.74 g/L。由表3可知，与对照组相比，实验组可显著提高乳酸和苹果酸含量（P＜0.05），降低乙酸、草酸和琥珀酸含量，对酒石酸和柠檬酸影响不显著（P＞0.05）。这与王芮东等[13]的研究结果一致，发酵过程中乳杆菌繁殖利用乙酸、草酸等产生更多的乳酸、苹果酸，导致乳酸、苹果酸含量升高。乳酸、苹果酸的增加可以提高中药的酸香味，乙酸、草酸的降低可以减少中药的刺鼻味[11]。其中，植物乳杆菌BLCC2-0410发酵效果最好，发酵复方中药72 h时，乳酸、苹果酸含量分别达到（19.25±0.15）g/kg、（4.06±0.18）g/kg，乙酸、草酸分别降低至（3.70±0.13）g/kg、（1.28±0.07）g/kg。

2.3 植物乳杆菌发酵对复方中药粗多糖和总黄酮含量的影响

植物乳杆菌发酵对复方中药粗多糖及总黄酮含量的影响分别见表4和表5。

表4 植物乳杆菌发酵对复方中药粗多糖含量的影响Table 4 Effect of Lactobacillus plantarum fermentation on crude polysaccharide contents of compound Chinese medicine%

表5 植物乳杆菌发酵对复方中药总黄酮含量的影响Table 5 Effect of Lactobacillus plantarum fermentation on total flavonoid contents of compound Chinese medicine%

粗多糖对氧自由基和羟自由基都有很好的清除作用，是一种天然抗氧化剂[14]。由表4可知，与对照组相比，实验组均可显著提高粗多糖含量（P＜0.05），且以植物乳杆菌BLCC2-0410发酵复方中药的粗多糖含量最高，发酵72 h时达到（5.83±0.15）%。分析原因主要是微生物代谢过程中会分泌大量纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、淀粉酶等胞外酶，可以使细胞间隙增大，细胞破裂，中药成分溶出，提高中药有效成分得率，随着处理时间的延长，溶出的多糖不断积累[15]。唐鑫等[16]研究发现，植物乳杆菌CCFM8661发酵天山雪莲粗多糖可达1.29 g/L。

有研究表明，总黄酮具有非常强的抗氧化以及消除自由基的作用[17]。由表5可知，与对照组相比，发酵24 h时，植物乳杆菌BLCC2-0126和BLCC2-0410发酵复方中药总黄酮含量显著升高（P＜0.05），分别提高12.13%和13.67%。总黄酮含量的增加，从结构上增加了活性OH基团，减少空间位阻，可以提高中药的抗氧化活性[17]。随发酵时间延长，植物乳杆菌发酵复方中药总黄酮含量均呈下降趋势，发酵48 h时，植物乳杆菌BLCC2-0126发酵复方中药中总黄酮含量显著低于对照组（P＜0.05），这可能是因为营养物质消耗殆尽，植物乳杆菌分泌多种糖苷酶分解黄酮糖苷类物质作为能源物质消耗[2]。

2.4 植物乳杆菌发酵对复方中药阿魏酸、甘草酸及甘草次酸含量的影响

2.4.1 植物乳杆菌发酵对复方中药阿魏酸含量的影响

阿魏酸是一种安全环保的天然抗菌剂，能够有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌[18]。植物乳杆菌发酵复方中药对阿魏酸含量的影响见表6。

由表6可知，与对照组相比，实验组均可显著提高阿魏酸含量（P＜0.05），且植物乳杆菌BLCC2-0126和BLCC2-0410发酵复方中药的阿魏酸含量显著高于植物乳杆菌BLCC2-0015（P＜0.05）。发酵24 h、48 h和72 h时均以植物乳杆菌BLCC2-0410发酵复方中药时阿魏酸含量最高，分别比对照组高211%、212%和289%，且随发酵时间的延长呈增加趋势。分析原因可能是，在植物细胞中阿魏酸通过苷键或酯键与纤维素等相连接，益生菌发酵可以产阿魏酸酯酶，水解阿魏酸与纤维素、半纤维素、木质素等相互作用的酯键，破坏细胞壁的致密网状结构释放出阿魏酸，使得阿魏酸含量升高[19-20]。结果表明，植物乳杆菌发酵可以提高复方中药中阿魏酸的含量，这与尹志娜等[21-22]的研究结果一致。

2.4.2 植物乳杆菌发酵对复方中药甘草酸及甘草次酸含量的影响

植物乳杆菌发酵对复方中药甘草酸和甘草次酸含量的影响见表7。甘草次酸具有抗炎、抗病毒和提高机体免疫力等作用[23]。由表7可知，与对照组相比，实验组甘草酸含量显著降低（P＜0.05），甘草次酸含量显著升高（P＜0.05），其中，植物乳杆菌BLCC2-0410发酵复方中药72 h时甘草次酸含量最高为517.9 mg/kg，比对照组高135.09%。分析原因可能是植物乳杆菌发酵复方中药产生甘草酸水解酶，水解甘草酸产生甘草次酸[24]。吕丽静等[25]研究发现，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）与植物乳杆菌发酵甘草药渣，甘草苷和甘草酸含量有所下降；樊梅娜等[26]研究发现，植物乳杆菌NBL-B3003发酵甘草24 h，甘草酸含量较未发酵降低90.44%。本研究中植物乳杆菌发酵甘草后甘草酸含量下降，推测亦可能是由于植物乳杆菌促进了甘草酸的生物转化引起的。同时已有研究表明，在体内甘草酸转化成甘草次酸后才发挥药理作用，包括解毒、抑制肝纤维化、抗炎和抗肿瘤等[27]。

3 结论

采用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0015、BLCC2-0126和BLCC2-0410固体发酵复方中药（黄芪、甘草和益母草等）后，可降低复方中药的pH值；提高乳杆菌活菌数，抑制大肠杆菌（Escherichia coli）及霉菌的生长；提高总酸、乳酸、苹果酸、粗多糖、阿魏酸及甘草次酸的含量。其中，植物乳杆菌BLCC2-0410发酵效果最好，发酵72 h时，复方中药的pH为4.32，乳杆菌活菌数为4.53×109CFU/g，大肠杆菌及霉菌未检出；总酸、乳酸、苹果酸、粗多糖、阿魏酸和甘草次酸含量均显著升高（P＜0.05），分别为27.82 g/kg、19.25 g/kg、4.06 g/kg、5.83%、42.00 mg/kg和517.9 mg/kg。