年龄相关肝病中的肝脏细胞异质性研究进展

李清钰，廖春雨，赵思羽，原玉柱，赵永睿，肖莉，孙丽新

1.中国药科大学江苏省药效研究与评价服务中心，江苏南京 211198；2.湖州师范学院生命科学学院浙江省媒介生物学与病原控制重点实验室，浙江湖州 313000

随着机体的衰老，肝脏的生物结构与功能不断退化，年龄相关肝病发病率增加。研究发现年龄相关肝病患者体内的多种肝脏细胞（肝细胞、肝窦内皮细胞、肝星状细胞及库普弗细胞）衰老表现形式不同，具体表现为蛋白质和生物标志物表达水平及细胞功能等方面的差异，即肝脏细胞异质性，但其相关疾病的具体机制与联系尚不清楚。本文就肝脏细胞衰老在相关疾病发生与发展中的作用进行综述，以期为延缓肝脏衰老及相关疾病治疗提供新靶点和新思路。

1 年龄相关肝脏疾病

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已成为我国最常见的慢性肝病，年龄是NAFLD 进展中密切相关的因素之一[1]。NAFLD包括单纯性脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）及相关的肝纤维化和肝硬化[2]。一项研究对患有NAFLD/NASH的人群进行肝脏活检和广泛的特征分析，结果表明NAFLD/NASH 患者体内多种衰老肝脏细胞增加[3]。同样的多项研究表明，在肝纤维化[4]、肝硬化[5]和肝细胞肝癌（hepatic cell carcinoma，HCC）[6]中，年龄均是高风险因素。此外，年龄也是酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）[7]、病毒性肝炎[8]等慢性肝病的影响因素之一。由此推测，肝脏细胞衰老可能在慢性肝病的发生与发展中发挥重要作用。

2 相关疾病中的肝脏细胞异质性

2.1 肝细胞

肝细胞是肝脏基本功能单位肝小叶中主要的实质细胞，也是肝脏功能的主要承担者。衰老肝细胞发生形态、功能及表观遗传修饰等方面的变化。衰老肝脏中肝细胞数量减少，体积增加[9]。随着年龄增长，NRF2 信号减退相关的氧化还原失衡会拮抗Wnt/β-catenin 信号通路，激活FoxO、p53 相关信号通路，从而削弱肝细胞增殖[10]。NASH 患者体内可见球形肝细胞，说明肝细胞发生变性，即微管破裂和严重损伤，表明肝细胞损伤可能推动NASH 进展[11]。

衰老肝细胞的衰老相关标志物表达增加，发生G1/S 期细胞周期阻滞。衰老肝细胞中细胞周期抑制因子p16Ink4a、p21 及p53 表达增加，衰老相关的β-半乳糖苷酶和异染色质蛋白1β 表达增加，氧化应激来源的脂质过氧化产物和脂滴积累，活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加[9]。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）可上调肝细胞中p16 和p21 水平，促进Rb 蛋白活化[12]。NAFLD 小鼠的肝细胞中p16、p53、p21 及衰老相关的β-半乳糖苷酶的表达水平上调[13]。此外，NAFLD 患者的肝细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependent kinases 4，CDK4）水平升高，而CDK4 抗性C/EBPα-S193A 小鼠则不会随着年龄的增长而发生肝脂肪变性，故抑制CDK4可能是慢性肝病治疗新途径[14]。因此，改善衰老肝细胞周期阻滞可能成为慢性肝病的潜在治疗策略。

衰老肝细胞释放白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）[15]。HBV 和丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）阳性肝硬化及HCC 患者的肝细胞中TNF-α 和IL-6 水平升高，且HBV 阳性HCC 患者的肝细胞过表达MMP-9 和低表达TIMP-1 和TIMP-3，从而获得更高的侵袭潜力[12]。由此推测，衰老肝细胞的SASP 加重慢性肝病，而抑制SASP 成分分泌可能有助于缓解病情。

衰老肝细胞自噬功能下降，蛋白质稳态丧失。氧化和错误折叠的蛋白质及其聚集体的积累可引发细胞蛋白质毒性，如脂褐素积累和ROS 产生增加，从而进一步抑制自噬，形成恶性循环[16]。NAFLD 小鼠的肝细胞自噬水平下调，表现为LC3II/LC3I 比率降低、自噬底物p62 蛋白积累及线粒体自噬相关蛋白Fundc1 表达减少[13]。因此，维持肝细胞自噬水平可能有助于延缓NAFLD 进展。

2.2 肝窦内皮细胞

肝窦内皮细胞（hepatic sinusoidal endothelial cell，LSEC）是肝脏中主要的非实质细胞，也是肝窦内壁的组成单位。衰老LSEC 中细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）等介导伪毛细血管化的标志物表达增加，小窝蛋白-1、参与调控肝细胞再生的无翅型MMTV 整合位点家族成员2（wingless-related MMTV integration site 2，Wnt2）及肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）表达减少[17]。衰老LSEC 发生伪毛细血管化，表现为窗孔变小、数量减少及内皮增厚，这些变化与窦周基底层形成和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）在窦周隙中的沉积增加有关。伪毛细血管化导致LSEC 内吞减弱，大分子清除率降低，这可能与清道夫受体功能受损相关[17]。伪毛细血管化的LSEC可激活静止的肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）使其转化为肌成纤维细胞，导致肝纤维化发生[18]；说明衰老LSEC 伪毛细血管化是慢性肝病发展的关键步骤，维持LSEC 的正常表型和功能可抑制NASH向肝纤维化的发展。另外，在LSEC 中阻断ICAM-1可抑制肿瘤细胞在体内外的粘附与迁移，提示下调衰老LSEC 中ICAM-1 表达，抑制LSEC 伪毛细血管化，有助于延缓HCC 进展[19]。

TNF-α、IL-1、IL-6 等SASP 成分在衰老LSEC中的表达相对增加[20]。与其他衰老肝脏细胞相比，p16INK4a主要在衰老LSEC 中表达[21]。年龄相关的氧化应激上调LSEC 中ROS 水平，且由于抗氧化酶血红素加氧酶-1 的表达减少，衰老LSEC 更易受氧化应激的损害[22]。

自噬对于LSEC 稳态维持十分重要，而衰老相关的氧化应激可导致LSEC 自噬失调，然而自噬失调也会削弱其处理氧化应激的能力，从而加重肝纤维化，形成恶性循环[23]。NASH 患者体内的LSEC 自噬失调上调趋化因子、细胞因子及黏附分子的表达，进而促进肝脏炎症、内皮-间质转化及肝纤维化过程[24]。因此，维持LSEC 自噬水平可能有助于延缓肝纤维化进展。

2.3 HSC

HSC 是位于Disse 间隙内的周细胞。迄今为止，衰老对HSC 影响的相关研究较少，但HSC 激活与肝纤维化发病及进展的联系一直是近年的研究热点。正常情况下HSC 处于静止状态，在肝损伤或衰老肝细胞诱导下被激活，活化的HSC 释放富含纤维蛋白的纳米级囊泡，这是肝纤维化与肝硬化发展的关键启动过程[13]。活化的HSC 高表达α-平滑肌肌动蛋白和结蛋白，并分泌过量的ECM 成分，如胶原蛋白和纤连蛋白，导致ECM 过度沉积，进而驱动肝纤维化进展[25]。衰老肝细胞中SIRT1 的年龄依赖性下降激活NLRP3 炎症小体炎症通路，进而驱动HSC 活化，导致老年ALD 小鼠的严重肝纤维化[26]。而衰老的HSC 分泌MMP，消化基质金属蛋白和胶原蛋白，从而减少ECM 沉积，以限制与逆转肝纤维化[25]。因此，诱导HSC 衰老可能是抑制肝纤维化发生与发展的有益机制。但是，衰老HSC 还表达SASP 相关成分，其似乎在NAFLD 进展为HCC 的过程中起关键作用[27]。

衰老HSC 自噬水平下调。而自噬可抑制活化HSC 释放纤维化细胞外囊泡，进而减轻肝纤维化[25]，故上调HSC 自噬水平可能是肝纤维化治疗策略。

2.4 库普弗细胞

库普弗细胞位于肝窦腔内，是肝脏常驻巨噬细胞中最具代表性的免疫细胞，参与感染和大分子吞噬的先天免疫反应。尽管库普弗细胞激活常见于肝脂肪变性、NASH 及肝纤维化等大多数慢性肝病，但与HSC 类似，衰老对库普弗细胞影响的研究并不多[28]。衰老对巨噬细胞的影响包括数量增加，在含有T、B 细胞的大淋巴结构中分布增加，吞噬、自噬作用减弱，并呈现促炎状态[29-30]；细胞因子分泌增加，如IL-6，但TNF-α、Mrc1、Arg1 及IL-10 的表达在衰老库普弗细胞中未发生变化[20]。

3 衰老肝脏细胞作为疾病治疗靶点

3.1 靶向消除衰老肝脏细胞

嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）-T细胞通过靶向消除表面高表达尿激酶型纤溶酶原激活物受体的衰老肝脏细胞，可改善CCl4 诱导或NASH 模型小鼠的肝纤维化和肝功能，表明Senolytic CAR-T 细胞对不同病因的肝纤维化均具有治疗作用[31]。BET 家族蛋白质降解剂通过减少非同源末端连接加剧DNA 双链断裂，并上调自噬基因表达，消除肥胖小鼠肝脏中衰老HSC，从而抑制HCC的发展[27]。但在WT 小鼠经达沙替尼+槲皮素给药被清除衰老HSC 后，显示出更多的纤维结缔组织增生，表明衰老HSC 的清除将加重肝纤维化；与之相反，诱导活化HSC 衰老则有益于肝纤维化消退[25,32]。由此可知，活化HSC 在不同慢性肝病中所发挥的作用不同，对其进行深入探究将有助于对不同慢性肝病患者进行针对性治疗。另外，衰老LSEC在体内仍然执行包括抗炎、内吞、分泌促肝细胞再生因子及维持HSC 表型等重要功能。通过基因工程手段靶向清除高表达p16INK4a的衰老LSEC 后，由于没有新的LSEC 来填补空缺，反而诱发了肝脏纤维化的发生[33]。因此，并非所有衰老肝脏细胞的清除均有利，衰老肝脏细胞清除治疗的靶向性显得尤为重要。

3.2 延缓肝脏细胞衰老

可溶性环氧化物水解酶/环氧合酶-2 双重抑制剂PTUPB 可通过SIRT1 抑制PI3K/AKT/mTOR 通路增强肝细胞自噬，进而延缓肝细胞衰老，从而减轻NAFLD；且PTUPB 对肝细胞衰老的延缓作用可进一步抑制HSC 活化，从而发挥肝纤维化治疗作用[13]。白藜芦醇激活SIRT1 或过表达SIRT1 和过表达胰岛素样生长因子1 可促进p53 去乙酰化，抑制核p53与早老素相互作用；进而减轻氧化应激引发的肝细胞过早衰老，维持LSEC 开窗，从而改善肝脂肪变性与纤维化[34]。然而，p53 作为DNA 损伤的细胞周期检查点，其被抑制可能会增加细胞癌变与肿瘤发生的概率，故针对p53 进行治疗的强度和时间需要精准把控[35]。另外，单细胞RNA 测序（scRNA-seq）和单细胞核RNA 测序（snRNA-seq）分析表明，热量限制通过调节肝脏细胞的ATG基因表达可激活自噬以抑制肝脏细胞衰老，故热量限制可能为未来年龄相关肝病治疗新途径[36]。

3.3 抑制衰老肝脏细胞SASP

甘露聚糖结合凝集素可直接与HSC 细胞表面低密度脂蛋白受体相关蛋白1 相关的钙网蛋白相互作用，通过上调哺乳动物的雷帕霉素/p53/p21 信号通路诱导活化HSC 衰老，使其增殖减弱、ECM 和SASP成分合成与分泌减少，从而促进肝纤维化消退[32]。然而，尽管诱导HSC 衰老对于减轻肝纤维化有益，但诱导活化的HSC 永久衰老可能会阻碍对于维持肝脏结构与功能至关重要的伤口愈合反应和ECM 维持，故诱导HSC 衰老进行肝纤维化治疗的强度和时间是需要考虑的重要问题[37]。CO 依赖性SIRT1 激活促进三四脯氨酸包含在应激颗粒中，进而下调肝细胞中SASP 成分纤溶酶原激活物抑制剂-1 水平，从而减轻肝细胞衰老与NAFLD[38]。但SASP 种类繁多，且衰老肝脏细胞并未被清除仍可继续分泌SASP 成分，故此治疗策略仅可改善症状，需与前两种治疗策略相结合以期达到协同治疗效果。

4 总结与展望

在与年龄相关肝脏疾病中，肝脏细胞表现出异质性，肝实质细胞和LSEC 具有衰老特征，而HSC和库普弗细胞虽然数量增加且被激活，但并未发生较多的衰老相关变化。肝脏细胞衰老是一把“双刃剑”，适度的细胞衰老有益于肝脏结构与功能的维持，并可抑制肝脏细胞癌变与肿瘤的发生，但衰老肝脏细胞的积累则可能是慢性肝病发生与发展的驱动力。此外，近年来scRNA-seq/snRNA-seq 成为高通量组学技术的热点，其可从基因组学、转录组学及蛋白质组学多角度更准确地检测衰老细胞中多种衰老标志物的组合，这有益于衰老细胞异质性的深入研究与疾病个性化治疗。

综上，肝脏细胞衰老与年龄相关肝脏疾病的发生与发展关系密切，靶向消除衰老肝细胞、延缓肝脏细胞的衰老及抑制衰老肝脏细胞SASP 等治疗策略的使用可有效延缓年龄相关肝脏疾病的发生、发展进程；但其之间复杂的机制与关系仍亟待阐明，以肝脏细胞衰老为靶点进行深入探究或成为慢性肝病治疗的新方向。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。