基于生物信息学筛选慢性肾脏病进展中自噬关键基因及潜在中药预测研究

桑田，王亿平

1.安徽中医药大学第一临床医学院，安徽合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院肾内科，安徽合肥 230031

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是一种渐进性疾病，其特点是由于各种原因造成的肾脏结构和功能的改变[1]。全世界约有10%的成年人受到某种形式的CKD 的影响，每年造成120 万人死亡和2800 万人的生命损失[2-3]。然而，CKD的致病基因和分子机制尚未完全阐明。识别与该病相关的新的关键风险基因对于发现潜在的治疗靶点具有重要意义，有助于深入理解CKD 的病理、生理过程，且对提升CKD 的早期诊断和治疗具有显著意义。自噬是一种关键的稳态机制，可清除各种受损或不需要的细胞内成分，以在应激条件下保护肾细胞。另外，自噬缺乏会增加肾脏损伤的易感性，导致肾功能下降、线粒体受损蓄积、严重肾纤维化和早期肾衰竭[4-5]。据报道，双酚A（bisphenol A，BPA）可通过升高的自噬相关基因5（autophagyrelated gene 5，Atg5）、自噬相关基因7（autophagyrelated gene 7，Atg7）、微管相关蛋白1A/1B 轻链3B（Map1lc3b/ Lc3b）和Beclin-1 基因水平调节自噬过程，加剧慢性肾损伤[6]。因此，需进一步研究来明确自噬相关基因在CKD 进展中的作用，挖掘潜在的治疗中药，对CKD 的诊断与治疗具有重要意义。

本研究旨在通过从基因表达总表（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库下载的整合基因表达谱数据来探索自噬相关基因在肾纤维化中的作用。利用支持向量机（support vector machine，SVM）模型确定关键自噬关键基因，对关键基因预测可能的治疗中药。本研究为研究CKD 的分子机制和探索治疗性中药提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 数据搜集

通过人类自噬数据库获得参与自噬的基因。利用GEO 数据库获得包含8 名健康对照者和54 例CKD患者的肾组织样本的GSE66494 数据集，基于平台注释文件将数据集中的探针标识转换为基因名，进行批次矫正后用于后续筛选差异表达基因。

1.2 差异表达分析和蛋白质-蛋白质相互作用分析

使用R 包“limma”分析232 个自噬相关基因在健康对照者和CKD 患者之间的差异表达水平，在|log2FC|>2 和校正后的P<0.05 的标准下，得到不同的自噬相关差异表达基因（differentially expressed autophagy-related genes，DEARGs），并利用ggplot2和pheatmap 包进行可视化处理。通过使用用于检索相互作用基因的搜索工具（STRING 11.0）研究DEARGs 的功能相互作用。然后通过Cytoscape 3.9.1构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction networks，PPI）网络。

1.3 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

为进一步研究自噬相关基因DEG 的富集途径和功能，将基因导入DAVID 6.8，并通过使用R 中的“ggplot2”包进一步可视化富集结果。

1.4 机器学习筛选关键基因

利用基于e1071 包的支持向量机-递归特征消除（support vector machine-recursive feature elimination，SVM-RFE）算法从重要DEG 中筛选特征基因，同时根据关键基因在正常样本和CKD 患者样本中的表达情况。利用受试者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC 曲线）评估关键基因诊断CKD 的有效性，并使用pROC 包绘制关键基因的ROC 曲线。

1.5 基于Coremine Medical 数据库的中药筛选

利用Coremine Medical 数据库作为分析工具，将筛选得到的关键基因输入该数据库进行进一步分析。通过设置统计学显著性阈值P<0.05，对基因与相应中药之间的关联性进行映射，以识别具有潜在治疗效果的中药。

2 结果

2.1 差异表达分析和蛋白质相互作用分析

从GEO 数据库提取232 个自噬相关基因进行差异分析，得到67 个DEARGs，见图1A。然后使用STRING 11.0 研究67 个DEARGs 的功能相互作用，通过Cytoscape 3.9.0 构建PPI 网络，如图1B。

图1 DEG 的筛选及PPI 网络分析

2.2 GO 生物功能富集分析与KEGG 途径富集化分析

为进一步探索67 个DEARGs 的富集途径和功能，将基因导入DAVID 6.8，并使用R 中的“ggplot2”包进一步可视化富集结果。这些基因主要参与大自噬、位于自噬体、主要表现为泛素−样蛋白连接酶结合，见图2A。KEGG 分析表明139 个DEARGs 主要参与巨自噬、自噬调节、细胞对外部刺激的反应等，见图2B。

图2 GO 生物功能富集分析与KEGG 途径富集化分析结果

2.3 SVM 筛选关键基因

为进一步缩小自噬相关基因的范围，使用SVMRFE 算法对67 个CKD 的DEARGs 进行进一步筛选，见图3A，得到2 个自噬关键基因ATF6、GNAI3。绘制ROC 曲线对关键基因的诊断效能进行评估，ROC曲线显示ATF6、GNAI3在曲线下面积（area under the curve，AUC）均接近1，即筛选出的2 个关键基因对区分CKD 患者与健康对照者具有较高的诊断效能，见图3B、图3D。

图3 机器学习筛选核心基因

2.4 中药预测结果

将2 个关键基因定位到Coremine Medical 数据库，根据P<0.05 为条件筛选治疗CKD 的潜在中药，获得姜黄、泽泻、丹参、地黄、五味子等多味中药，见表1。

表1 关键基因相关中药预测

3 讨论

各种慢性进展性肾病的最终表现均为肾纤维化，肾纤维化是导致CKD 发展到终末期肾脏疾病（end-stage kidney disease，ESRD）的主要病理基础，而自噬在纤维化相关的CKD 的进展中起关键作用[7]。因此，探索和发现自噬参与肾纤维化的潜在机制对于发现CKD 的潜在治疗靶点极为重要。

本研究获得67 个差异表达的自噬相关基因，并用于GO 功能和KEGG 通路分析，综合DEARGs 的富集结果发现自噬相关基因主要与巨自噬密切相关。在应激条件下，巨自噬作为一种生存机制发挥重要作用，主要负责大分子、细胞膜和细胞器的更新，维持细胞内环境的稳态[8]。这一过程通过循环利用受损和有毒的细胞组分，转化为细胞的构建模块，从而支持细胞抵御应激反应并维持能量平衡[9]。此外，巨噬细胞在调控炎症反应和纤维化过程中扮演着关键角色[10]。因此，自噬相关基因可能在肾纤维化的进程中起重要作用。

SVM 模型的进一步构建鉴定出2 个自噬关键基因ATF6和GNAI3。ATF6（激活转录因子6）是一种重要的传感器，当内质网应激诱导未折叠蛋白反应时被激活。研究发现miR-185-5p可通过下调ATF6改善内质网应激相关蛋白的表达并抑制上皮去分化，进而改善肾纤维化[11]。其亚型ATF6α下调过氧化物酶体增殖物激活受体α 促进脂毒性诱导的肾小管间质纤维化[12]。因此ATF6可能成为防治CKD 的有效靶点。GNAI3（G 蛋白亚基αI3）是一种蛋白质编码基因。与GNAI3相关的疾病包括耳髁综合征1和耳髁综合征[13-14]。有研究表明GNAI3可作为胰腺癌预后的独立预测因子和治疗非酒精性脂肪性肝病的潜在新靶点，还被鉴定为川崎病和结肠炎相关肿瘤的关键调控基因[15-18]。然而，GNAI3在CKD 中的作用尚未报道，需要对该基因进行进一步研究。同时，本研究绘制数据集的ATF6、GNAI3的ROC 曲线结果显示，ATF6和GNAI3的ROC AUC 接近1，表明这2 个标志物在区分CKD 患者和非患者方面显示出高度的诊断效能。但由于样本量的限制，关键基因的诊断价值可能需要进一步检验。

近年来中医药在CKD 防治中受到了更多的关注，在CKD 的发展至ESRD 的过程中，中医药在缓解临床表现、减缓疾病进展速度及延后肾脏替代疗法启动时间等方面展现出显著的疗效优势。本文以自噬关键基因筛选治疗CKD 的潜在中药，得到丹参、泽泻、地黄、姜黄和五味子等多味中药。研究发现姜黄中的姜黄素具有抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤等作用，并可通过腺苷酸激活蛋白激酶信号通路促进自噬从而减轻大鼠糖尿病肾病的肾脏纤维化[19]。地黄的主要活性成分地黄多糖通过缓解CKD 大鼠冠脉钙化，抑制冠脉血管平滑肌细胞中TRPC1/6 蛋白的表达并促进自噬[20]。在单侧输尿管梗阻诱导的大鼠肾脏病理模型中，丹参的主要活性成分丹酚酸B 通过调节自噬相关蛋白的表达来发挥作用。具体而言，丹酚酸B 可通过上调LC3-Ⅱ和Beclin1 的表达，同时下调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的表达，从而激活自噬过程，并对抗肾间质纤维化的发展[21]。另外，泽泻在此模型中展现出对肾小管上皮细胞间充质转分化的显著抑制作用，减轻肾间质纤维化，并观察到肾小管上皮细胞中C3 蛋白表达的下调，这表明泽泻可能通过影响C3 途径来抑制间充质转分化的过程[22]。五味子中的有效成分五味子乙素可能通过调节自噬相关蛋白LC3 对缺氧/复氧肾小管上皮细胞的凋亡有一定的保护作用[23]。木通中的有效成分马兜铃酸在低剂量引起的肾损伤过程中可能发生自噬，且自噬减轻肾脏损伤；马兜铃酸高剂量引起的肾损伤过程中可能发生过度自噬，且自噬加重肾脏损伤，其作用机制可能与调节p53 蛋白表达相关[24]。

总之，本研究通过生物信息学的方法，为CKD与自噬之间联系的进一步研究提供新的见解和潜在靶点。筛选的关键基因及中药可为后续深入理解CKD 的分子机制和开发治疗药物奠定理论基础。本研究存在一定的不足，如关键基因ATF6、GNAI3的表达水平，可能需要进一步的定量聚合酶链式反应和免疫印迹或免疫组织化学验证。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。