半枝莲治疗恶性胸腔积液作用机制的网络药理及分子对接研究

2024-03-16陈宇骆学新

中国现代医生 2024年6期

陈宇骆学新

[摘要] 目的通过网络药理和分子对接方法，探究半枝莲治疗恶性胸腔积液（malignant pleural effusion，MPE）的作用机制。方法利用IBW SPSS Modeler 18.0软件对绍兴第二医院中医科门诊治疗MPE处方信息进行数据挖掘，使用中药系统药理学数据库与分析平台筛选半枝莲有效活性成分，利用GeneCards、OMIM、DisGeNET数据库获取MPE疾病靶点，通过Cytoscape3.9.1软件构建“中药-成分-靶点”网络图。利用DAVID在线平台生成基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析图和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析图。使用PyMol和AutoDock vina软件将半枝莲有效活性成分与核心靶点蛋白进行分子对接验证。结果半枝莲治疗MPE的主要活性成分有18种，其中黄芩黄酮、3-甲基鼠李素、荠苧黄酮、黄芩素、木犀草素等为主要活性成分，EGFR、AKT1、HIF1A、SRC等为核心靶点蛋白。结论半枝莲通过多成分、多靶点作用于MPE，为进一步研发MPE治疗药物提供理論基础和新的切入点。

[关键词] 半枝莲；恶性胸腔积液；网络药理学；分子对接技术

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.06.016

Network pharmacology and molecular docking of the Sculellaria barbata in the treatment of malignant pleural effusion

CHEN Yu1， LUO Xuexin2

1.The Second School of Clinical Medicine， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， Zhejiang， China; 2.Traditional Chinese Medicine Department， Shaoxing Second Hospital， Shaoxing 312000， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To explore the mechanism of Scutellaria barbata in treating malignant pleural effusion （MPE） through network pharmacology and molecular docking methods. Methods Using IBW SPSS Modeler 18.0 software to data mine the malignant pleural effusion prescription information in the Outpatient Department of Traditional Chinese Medicine， Shaoxing Second Hospital. Using the Chinese medicine system pharmacology database and analysis platform screening lotus effective active ingredients and related targets， malignant pleural effusion disease targets in GeneCards， OMIM， DisGeNET database， the network diagram of “TCM-component-target” was constructed through Cytoscape3.9.1 software. The DAVID online platform was used to generate the gene ontology （GO） and functional enrichment analysis map and the pathway enrichment analysis map of Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes （KEGG）. Using PyMol and AutoDock vina software to test the molecular docking of the active components with core target proteins. Results There are 18 main active ingredients in the treatment of MPE with Scutellaria barbata， among which baicalin， 3-methylrhamnosum， shepherds purse flavonoids， baicalin， luteolin， etc. are the main active ingredients， and EGFR， AKT1， HIF1A， SRC， etc. are the core target proteins. Conclusion Banzhilian acts on malignant pleural effusion through multiple components and targets， providing a theoretical basis and new entry point for the further development of drugs for the treatment of malignant pleural effusion.

[Key words] Sculellaria barbata; Malignant pleural effusion; Network pharmacology; Molecular docking technology

半枝莲为唇形科黄芩属植物半枝莲的干燥全草，性寒，味辛、苦，归肺、肝、肾经，主要化学成分为黄酮类、多糖类、二萜类等，主要功效为清热解毒、化瘀利尿[1]。现代药理研究表明半枝莲中的黄酮类成分具有多种药理活性，如抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗炎等，是潜在的天然抗氧化剂，临床应用前景广泛[2]。

恶性胸腔积液（malignant pleural effusion，MPE）是指原发于胸膜的恶性肿瘤或其他恶性肿瘤转移至胸膜而引起的胸腔积液[3]。在我国MPE的发生率约占胸腔积液的29.6%[4]。多项研究表明半枝莲对MPE具有有效治疗作用。MPE患者机体处于氧化应激状态，MPE的形成与过量自由基引起脂质过氧化使毒性液体渗入胸膜腔有关[5-6]。半枝莲具有较强的抗氧化作用，可有效清除1–二苯基–2–三硝基苯肼、2–联氮–二铵盐等自由基[7]。金志超[8]以半枝莲、葶苈子等自拟中药消水方，通过实验发现消水方可减少MPE模型小鼠的MPE生成量，延长小鼠的生存时间。李佩文经过长期临床实践，认为半枝莲具有化瘀利水、抗肿瘤的功效，可有效治疗MPE[9]。沈敏鹤善用半枝莲、沙参、麦冬等为基础方治疗MPE，起到养肺阴而不恋邪，消悬饮而不伤正的功效[10]。因此探测半枝莲对MPE的有效药物成分及作用潜力对后续药物研发具有重要意义。本研究运用网络药理学方法和分子对接技术，将半枝莲主要药物活性成分与MPE核心靶点进行对接分析，为深入研究半枝莲治疗MPE提供新思路和理论依据。

1 资料与方法

1.1 数据挖掘

选取2021年1月至2023年1月就诊于绍兴第二医院骆学新中医门诊的MPE患者96例。其中男38例、女58例，平均年龄（51.36±13.29）岁。利用IBW SPSS Modeler 18.0软件进行数据挖掘；利用Excel软件对收集的处方进行中药频数分析。

1.2 半枝莲成分收集与筛选

以“半枝莲”或“banzhilian”为关键词在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicines Systems Pharmacology Platform，TCMSP）查询半枝莲的化学成分。首先以生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18为条件进行筛选，再利用Swiss ADME平台以胃肠道吸收得分为“high”，类药性至少通过2个“Yes”为条件筛选药物活性成分。

1.3 MPE疾病靶点的收集

在GeneCards、OMIM、DisGeNET数据库中以“Malignant Pleural Effusion”为关键词，检索并筛选MPE作用的相关基因。

1.4 半枝莲活性成分-MPE靶点网络构建

利用Venny 2.1在线工具对药物活性成分和疾病靶点基因取交集，得到共同靶点交集基因。将其导入STRING在线数据库，构建交集靶点蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络图。使用Cytoscape3.9.1软件对PPI网络进行可视化分析，筛选出核心靶点，并绘制“中药-活性成分-靶点”网络图。

1.5 京都基因与基因组百科全书通路富集与基因本体生物过程分析

利用DAVID在线平台对共同靶点交集基因进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析和基因本体（gene ontology，GO）分析（P<0.05为筛选条件），对KEGG通路富集进行可视化分析并绘制气泡图，GO分析按基因数进行可视化分析并绘制气泡图。

1.6 分析对接验证

利用AutoDock vina软件，将1.4项中的药物活性成分进行拓扑分析，筛选出度值排名前5位的活性成分与筛选出的MPE核心靶点进行分子对接。

2 结果

2.1 中药频数分析

96首治疗MPE中药方中共有134味药，使用频率排名前6的中药见表1，其中使用频次最高的中药为半枝莲。

2.2 半枝莲活性成分的筛选

在TCMSP数据库中以OB≥30%和DL≥0.18为筛选标准，且利用Swiss ADME平台以GI absorption得分为“high”，DL至少通过2个“Yes”作为筛选条件，得到18条半枝莲有效活性成分，见表2。

2.3 靶点基因的收集和整理

选取在GeneCards数据库中>中位数6.3的MPE靶点基因，合并OMIM、DisGeNET数据库中靶点基因，共得到879条MPE相关靶点基因。

2.4 構建“药物-成分-靶点”网络

根据半枝莲药物活性成分和MPE相关靶点绘制韦恩图，获取87个共同靶点基因，即半枝莲治疗MPE的潜在靶点。通过Cytoscape软件对PPI网络进行可视化分析，根据度值排名发现半枝莲治疗MPE的核心靶点可能是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/ threonine-protein kinase，AKT1）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、非受体酪氨酸激酶（sarcoma receptor coactivator，SRC）、肿瘤缺氧信号通路的中枢因子（hypoxia inducible factor 1-alpha，HIF1A）等，并绘制核心靶点筛选过程，见图1。将半枝莲有效活性成分与共同靶点基因匹配，绘制“药物-成分-靶点”网络图，见图2。结果显示半枝莲通过多成分、多靶点作用于MPE。

2.5 生物功能和通路富集分析

GO分析结果显示半枝莲作用于MPE靶基因的生物过程（biological progress，BP）主要涉及跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、蛋白质自磷酸化等，见图3。分子功能（molecular function，MF）主要涉及三磷酸腺苷结合、蛋白酪氨酸激酶活性等，见图4。细胞组成（cellular component，CC）主要涉及胞外区、大分子复合物、核质等，见图5。KEGG通路富集结果见图6，通路主要包括癌症通路、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt ）信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性通路等，提示以上可能是半枝莲作用于MPE的主要通路。

2.6 分子对接验证

将黄芩黄酮、3-甲基鼠李素、薺苧黄酮、黄芩素、木犀草素分别与AKT1、EGFR、SRC、HIF1A进行分子对接。所有对接结果结合能均<-5，对接结果较好，其中分子对接结果较好的有荠苧黄酮与AKT1（结合能-5.81）、3-甲基鼠李素与EGFR（结合能-5.4）等。分子对接三维结果见图7和图8，分子对接表面模型见图9和图10。此结果进一步确认了网络药理预测结果的置信度。

3 讨论

MPE在中医属于“悬饮”“癖饮”等范畴[11]。《金匮要略》记载：“饮后水流胁下，咳唾引痛，谓之悬饮。”虽然MPE的诊疗日趋精准，但目前的药物治疗仍存在单靶点、单通路、毒副作用、耐药等问题。因此，寻求多靶点、多途径、低副反应、疗效确切的抗肿瘤药物或方法是目前MPE的研究热点。

本研究通过使用生物信息技术，构建“中药-有效成分-靶点”网络，筛选得到半枝莲治疗MPE的主要活性成分有18种，其中黄芩黄酮、3-甲基鼠李素、荠苧黄酮、黄芩素、木犀草素具有较高的度值和相关性。已有研究表明黄芩黄酮在多种肿瘤中具有抗肿瘤活性作用，黄芩黄酮可作用于特定的肿瘤细胞诱导自噬相关死亡[12]；3-甲基鼠李素具有有效的抗炎、抗氧化特性，可通过miR-34a/Notch-1信号通路诱导人乳腺癌细胞凋亡[13]；荠苧黄酮可缓解机体氧化应激，调节凋亡相关蛋白，改善机体能量代谢[14]；黄芩素可抑制SW480细胞增殖，诱导细胞皱缩并发生凋亡[15]；木犀草素与肿瘤发生、细胞发育、死亡密切相关[16]。在分子对接结果中，EGFR、AKT1、HIF1A、SRC等靶点具有较高的结合力。AKT1为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族中高度同源亚型的一种，EGFR是表皮生长因子家族的第一位成员[17]；AKT1和EGFR都具有广泛的生物学效应，参与调节肿瘤细胞增殖、分裂、凋亡等多个过程[18]。Yapeng等[19]对80例晚期肺腺癌MPE患者使用表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）联合内皮抑素治疗效果显著高于对照组。AKT1、EGFR靶点可联合作用于抑制细胞凋亡过程、参与细胞存活途径来治疗MPE。

SRC是非受体酪氨酸激酶，同样具有调控癌基因的作用[20]。Ahandoust等[21]通过实验研究发现细胞内和细胞外结构域的膜突蛋白（moesins，MSN）在促癌信号中呈相反作用，过表达MSN可增加SRC的活性。这表明可通过调控MSN来影响SRC通路进而治疗MPE。HIF1A可作为转录基因调节多种基因的转录，其下游的靶基因参与血管新生、糖酵解等多种细胞功能，MPE中HIF1A相关的诊断及潜在的治疗靶点有待进一步挖掘[22-23]。Quanlei等[24]在64个个体生物芯片研究中发现miR-195-5p、miR-182-5p对良MPE具有明显的鉴别诊断作用，而HIF1A的mRNA和蛋白质的表达下调。因此miR-195-5p、miR-182-5p可能是通过干预HIF1A参与MPE的病理过程。

通过GO分析发现半枝莲作用于MPE主要的生物过程涉及跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、蛋白质自磷酸化等。KEGG通路富集分析结果显示半枝莲治疗MPE的重要信号通路包括癌症相关通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性通路等。Li等[25]发现晚期肺癌患者接受一线化疗或靶向治疗后，胸腔积液中EGFR突变率高达88.5%，EGFR基因突变的患者较无突变患者EGFR-TKI治疗疗效好，EGFR基因是否突变可作为TKI治疗的重要预测因子[26-27]。EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性通路对于指导临床选择EGFR-TKI治疗MPE具有重要意义。分子对接结果显示半枝莲药物活性成分小分子均与作用靶点完成较好对接，进一步验证了半枝莲可有效作用于MPE的猜想。

目前关于半枝莲治疗MPE的研究更多是复方研究，但在MPE的临床治疗中半枝莲单药应用广泛。本研究通过数据挖掘和生物信息技术分析发现半枝莲可通过多组分、多靶点、多途径治疗MPE，为后续MPE的相关研究及临床防治奠定基础。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

徐硕，徐文峰，邝咏梅，等. 中药半枝莲质量评价的研究进展[J]. 西北药学杂志， 2023， 38（1）： 222–226.
杜义龙，李赛，李艳荣，等. 半枝莲标准汤剂的指纹图谱建立与抗氧化活性成分的化学模式识别[J]. 2022， 33（4）： 425–432.
YANG L， WANG Y. Malignant pleural effusion diagnosis and therapy[J]. Open Life Sci， 2023， 18（1）： 20220575.
王景民，马曼曼，高孟秋. 结核感染T细胞斑点试验在鉴别结核性与恶性胸腔积液中的价值研究[J]. 陕西医学杂志， 2021， 50（9）： 1147–1149， 1153.
刘晓菊，赵晋，刘卫，等. 恶性胸腔积液患者全身及病灶局部氧化抗氧化状态的研究[J]. 兰州大学学报（医学版）， 2008（1）： 5–9.
TANDON R， MISHRA J K， MANISH S， et al. Lipid peroxidation products and nitric oxide in the evaluation of benign and malignant pleural effusion[J]. J Physio Biochem， 2021， 2（8）： 138–144.
杜义龙，李赛，李艳荣，等. 半枝莲标准汤剂的指纹图谱建立与抗氧化活性成分的化学模式识别[J]. 中国药房， 2022， 33（4）： 425–432.
金志超. 基于自噬调控肿瘤相关巨噬细胞表型极化探讨消水方治疗恶性胸腔积液的作用机制[D]. 北京：中国中医科学院， 2018.
汪欣文，姚龑茹，董新刚，等. 李佩文合用半边莲、半枝莲治疗癌性胸腹水经验举隅[J]. 山西中医， 2018， 34（4）： 6–8.
张洁. 沈敏鹤教授论肿瘤病饮证治验撷菁[J]. 中国实用医药， 2008， 3（33）： 180–181.
骆学新，洪国标，童海江. 加味小陷胸汤联合顺铂胸腔内化疗治疗恶性胸腔积液的疗效及对相关因子的影响[J]. 浙江中医杂志， 2019， 54（4）： 242–243.
TULI H S， BHUSHAN S， KUMAR A， et al. Autophagy induction by scutellaria flavones in cancer： Recent advances[J]. Pharmaceuticals， 2023， 16（2）： 302.
LAN L， WANG Y， PAN Z， et al. Rhamnetin induces apoptosis in human breast cancer cells via the miR-34a/ Notch-1 signaling pathway[J]. Oncol Lett， 2019， 17（1）： 676– 682.
刘睿，邵瑾，赵彤，等. 荠苧黄酮对低压低氧小鼠心肌损伤的改善作用与机制研究[J]. 中国新药杂志， 2021， 30（1）： 55–61.
徐佳丽，路上云，王佳，等. 黄芩素通过诱导活性氧产生抑制MET/Akt信号通路促进人结肠癌SW480细胞凋亡[J]. 中国药理学与毒理学杂志， 2022， 36（11）： 812–818.
陈侠，来慧丽，赖满香，等. 木犀草素上调miR-384对胶质瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响[J]. 沈阳药科大学学报， 2023， 40（2）： 185–191.
EIDE I， NILSSEN Y， STENALAND E， et al. Real- world data on EGFR and ALK testing and TKI usage in norway-a nation-wide population study[J]. Cancers， 2023， 15（5）： 1505.
ZHANG P， SUN Y， SHI Y， et al. Effect of isorhamnetin on carbonic anbydrase ⅠX expression and tumorigenesis of bladder cancer by activating PPAPγ/PTEN/AKT pathway[J]. Tissue Cell， 2023， 82（6）： 102048.
YAPENG G， YANG L， LILI P， et al. Efficacy of endostatin combined with EGFR-TKIs in the treatment of malignant pleural effusion in EGFR-positive advanced lung adenocarcinoma[J]. JCMP， 2022， 4（11）： 9.
张鹤，赵晓宇，郑锐，等. Src酪氨酸激酶抑制剂对表皮生长因子诱导的肺腺癌细胞生长的作用及机制[J]. 中国医科大学学报， 2023， 52（2）： 132–136.
AHANDOUST S， LI K， SUN X， et al. Intracellular and extracellular moesins differentially regulate Src activity and β-catenin translocation to the nucleus in breast cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2023， 639： 62–69.
王平，閉水清，刘畅，等. 人胶质瘤中HIF1A和MAGED4的表达及调控关系初探[J]. 中国临床新医学， 2022， 15（10）： 945–950.
ZHAO Y， YANG Z， MA L， et al. HIF1A overexpression predicts the high lymph node metastasis risk and indicate a poor prognosis in papillary thyroid cancer[J]. Heliyon， 2023， 9（3）： e14714.
QUANLEI B， YAPING X， MING D， et al. Identification of differentially expressed miRNAs in differentiating benign from malignant pleural effusion[J]. Hereditas， 2020， 157（1）： 6.
LI H， YAN S， LIU X， et al. Disparities of EGFR mutations between biopsy and rebiopsy in non-small cell lung cancer patients[J]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi， 2018， 21（11）： 821–827.
丁丽，张萍，武晓楠，等. 非小细胞肺癌患者胸腔积液肿瘤细胞EGFR基因突变检测及其在治疗中的价值[J]. 河北医科大学学报， 2011， 32（1）： 1–4.
鲁涛，李强，李岚，等. 132例晚期非小细胞肺癌胸腔积液EGFR基因突变检测结果及其临床意义：一项来自单中心的回顾性研究[J]. 中国肺癌杂志， 2020， 23（12）： 1059–1065.