检测棘球蚴病患者血清内循环抗原的免疫层析试条的制备和评价

张 璟,王 颖,高春花,危芙蓉,贾孝凯,石 锋

棘球蚴病又称包虫病,是由棘球绦虫的幼虫寄生所致的人兽共患的传染性疾病。我国西部是世界上棘球蚴病患病率最高的地区,主要流行两种棘球蚴病,即细粒棘球蚴病(Cystic echinococcosis, CE,又称囊型包虫病)和多房棘球蚴病(Alveolar echinococcosis, AE,又称泡型包虫病)。包虫病是当前我国疾病负担最严重的寄生虫病[1-3],快速准确的诊断方法对于棘球蚴病的有效控制具有重要意义。迄今,已有多种基于检测循环抗体的棘球蚴病诊断产品问世并在实验室和现场使用,但检测循环抗体无法区分既往感染和现症感染,不利于病人的早期诊断和流行病控制策略的及时制定和实施[4-6]。有研究表明,棘球蚴纯化包囊液粗抗原(Hydatid cyst fluid, HCF)检测包虫病的效能较高[7]。本研究制备了纯化包囊液粗抗原的特异性单克隆抗体,研制了以双抗夹心的抗原捕获法为基础的快速诊断包虫病的胶体金免疫层析试条,并对其检测效果进行了评价。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器 1640培养基购自美国Invitrogen公司;新生小牛血清购自杭州四季青工程材料有限公司;HRP标记羊抗小鼠IgG购自生工生物工程有限公司;小鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自洛阳佰奥通实验材料中心;G蛋白层析柱购自美国Thermofisher公司;羊抗小鼠IgG购自英国Cohesion Bio公司;硝酸纤维素膜(CN140)、交联释放垫(8964)、吸水垫(H5072)和样品垫(GRADE2)由上海杰一生物技术有限公司提供;氯金酸(HAuCl·Cl3·4H2O)(沪试牌)购自上海国药集团化学试剂有限公司;XZ1000型喷膜机、CM4000型切条机为美国Bio-Dot公司产品。

1.2 血清样品 确诊棘球蚴病患者血清127份,其中细粒棘球蚴病患者血清87份,多房棘球蚴病患者血清40份,囊尾蚴病病人血清25份、日本血吸虫病患者血清10份,弓形虫病、并殖吸虫病和华支睾吸虫病患者血清各5份,健康人血清60份,由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心)和新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心提供。本研究获得中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心)伦理审查委员会批准,并取得受试者的知情同意。

1.3 纯化HCF的制备 按参考文献[8]进行。取新鲜羊肝包囊液,以1 000×g离心30 min除去沉淀,上清液装入透析袋,对pH5.0的5 mmol/L乙酸缓冲液于4 ℃下透析;回收透析液50 000×g离心30 min,除去上清白蛋白;沉淀用pH8.0的200 mmol/L的PBS溶解,加饱和硫酸铵至40%,18 000×g离心30 min除去沉淀球蛋白,即得纯化囊液粗抗原。

1.4 单克隆抗体的制备与初步分析

1.4.1 免疫 按文献[9]方法,免疫BALB/c小鼠,每只首次腹腔注射250 μL(约100 μg)纯化的囊液粗抗原与250 μL福氏完全佐剂的混悬液,之后第30 d、60 d各注射50 μg纯化的囊液粗抗原与福氏不完全佐剂的混悬液1次,第90 d经尾静脉直接注射50 μg抗原加强免疫1次,第93 d取免疫小鼠的脾脏进行细胞融合。

1.4.2 杂交瘤细胞的产生与筛选 按本实验室常规方法进行SP2/0瘤细胞与免疫小鼠脾细胞的融合及杂交瘤细胞的克隆[9]。对杂交瘤细胞培养上清进行抗原ELISA检测抗体分泌,收集对纯化的囊液粗抗原反应的克隆。

1.4.3 单克隆抗体(McAb)免疫球蛋白亚类鉴定 按照小鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒的说明书分别与羊抗鼠IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3进行反应以鉴定McAb免疫球蛋白亚类。

1.4.4 腹水制备与效价测定 将收集的杂交瘤细胞接种BALB/c小鼠,每只BALB/c小鼠腹腔注射5×106杂交瘤细胞,1周左右观察小鼠的精神状态和腹水量,并及时收取腹水,用常规ELISA法确定腹水效价。

1.5 单克隆抗体的配对和免疫层析试条的制备 采用G蛋白层析柱按其产品说明书纯化单克隆抗体。参照文献[10-11]用柠檬酸三钠还原法制备胶体金并用胶体金标记单克隆抗体。纯化的单克隆抗体分别作标记抗体和包被抗体,与其他抗体进行配对,筛选检测敏感性和特异性均佳的抗体对用于制备试条。将筛选得到的单克隆抗体和羊抗鼠IgG分别喷涂在NC膜上适当位置形成检测线和质控线制成试条。

1.6 免疫层析试条检测条件的选取 将适量样本血清加在样品垫上,然后滴加适量样本稀释液,适时观察并记录检测结果。

1.7 试条性能的评价 用制备的试条对上述包虫病患者血清、其他寄生虫病患者血清和健康者血清采取单盲法检测。检测结束后将试条检测结果与病原学方法检测结果进行比较,统计试条检测的敏感性和特异性。分别制备3批试条对同样的血清进行重复检测。

1.8 统计学分析 采用SPSS 11.0 软件对试条检测囊型和泡型包虫病结果进行χ2检验,检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 羊棘球蚴囊液抗原的纯化 将从我国新疆流行区收集的羊肝棘球蚴囊液离心后去除原头节,上清液经透析和饱和硫酸铵沉淀后除去白蛋白和球蛋白,即得纯化囊液粗抗原(图1)。

注:M.标准蛋白分子量;1.纯化前羊细粒棘球蚴囊液;2.纯化中间产物;3.分离的杂蛋白;4.纯化后的羊细粒棘球蚴囊液抗原

2.2 单克隆抗体的制备与初步鉴定 以纯化羊细粒棘球蚴囊液免疫小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0瘤细胞融合,经筛选获得11株高效分泌针对重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤, 用杂交瘤培养上清对相应的单克隆抗体的亚类进行了鉴定(表1) ,将这些杂交瘤接种小鼠腹腔均获得了含高效价单克隆抗体的腹水(表1) 。

表1 单克隆抗体特性

2.3 单克隆抗体配对和试条的制备 制备的11株单克隆抗体分别作为包被抗体和标记抗体进行配对实验, 经比较选择单克隆抗体F3B6标记胶体金作为检测抗体, 选择C4H6作包被抗体, 检测效果最佳。检测线上的C4H6单克隆抗体工作浓度为1.2 mg/mL,喷涂量为1 μL/cm;质控线羊抗鼠IgG工作浓度为1.0 mg/mL,喷涂量为1 μL/cm;胶体金标记探针F3B6单克隆抗体的工作浓度(以蛋白浓度计):20 μg/mL,喷涂量为40 μL/cm。

2.4 试条的检测条件 每次检测取5 μL血清,滴加在试条底部样品垫上,再缓慢滴加3滴(120～200 μL)样本稀释液。检测线和质控线出现红色条带,不论强弱即判为阳性;若仅有质控线显色判为阴性(图2)。检测结果均在15 min 内判断。

注:1-10.阳性样本检测结果;11-20.阴性样本检测结果

2.5 试条法检测结果 分别用3批制备的试条对包虫病患者血清、其他寄生虫病患者血清和健康者血清进行检测,批次间检测结果完全符合。用研制的试条检测127份棘球蚴病患者血清的敏感性为88.12%(112/127),其中试条检测囊型包虫病患者血清的敏感性为88.51%(77/87),检测泡型包虫病患者血清的敏感性为87.5%(35/40),试条法检测两型包虫病患者血清敏感性之间差异无统计学意义(χ2=0.03,P=0.86)。与25份囊尾蚴病患者血清、10份日本血吸虫病患者血清、5份弓形虫病患者血清、5份并殖吸虫病患者血清和5份华支睾吸虫病患者血清均无交叉反应,60份健康者血清也均为阴性,总特异性为100.00%(表2)。

表2 试条法检测寄生虫病患者和健康人血清

3 讨 论

目前,对包虫病的诊断主要依赖影像学方法[12],由于该方法不能进行早期诊断,易造成患者错过最佳药物治疗期,同时该方法需要使用仪器,对技术要求高,不适合于大规模防治的需要。免疫学诊断方法具有敏感特异的特点,目前应用的检测包虫病方法均基于检测特异抗体,其检测效能极大地依赖所应用的抗原。本课题组用ELISA方法评价了细粒棘球蚴纯化囊液粗抗原、天然抗原B(nAgB)及其3个重组亚基(rAgB8/1、rAgB8/2和rAgB8/3)检测囊型包虫病的效能,结果显示天然抗原应用ELISA法检测囊型包虫病的效能总体优于重组抗原[7],并以细粒棘球蚴包囊液纯化抗原(检测CE)和EM18重组蛋白(检测AE)分别作为包被抗原,以抗IgG抗体标记胶体金作为检测试剂,研制出了能够区分检测两型包虫病特异抗体的免疫层析试条。该试条检测包虫病的敏感性和特异性均达到90%以上[6,13],但囊液抗原存在不易标准化,与其他寄生虫病患者血清存在不同程度的交叉反应的问题[7]。另外,由于抗体在包虫病患者治疗后仍可长时间存在,不能区分既往感染和当前感染,而检测宿主体液中的循环抗原则可准确地判断宿主体内有无棘球蚴存在,为确定原发、继发、再感染及疗效考核提供依据。已有不同作者应用单克隆抗体夹心ELISA[14]、dot-ELISA[15]和免疫金银法[16]检测棘球蚴病患者血清中的循环抗原的报道,但由于循环抗原在血清中含量甚微和检测方法的限制,阳性率低,不适合现场应用。

本研究制备棘球蚴囊液纯化抗原特异性单克隆抗体,以此单克隆抗体为基础研制的胶体金免疫层析试条,用以检测人棘球蚴病血清中的循环抗原敏感性为88.51%(77/87),检测其他寄生虫病患者血清和健康人血清也表现出很好的特异性,高达100%,检测囊型包虫病和泡型包虫病患者血清敏感性之间差异无统计学意义(χ2=0.03,P=0.86)。该试条具有操作快速、简便,无需任何仪器和设备;性能稳定,重复性好,结果判断客观,样品无需冷藏等优点,特别适合现场应用。

本研究筛选到的单克隆抗体F3B6和C4H6对囊型包虫病和泡型包虫病患者血清均有反应,以此制备的试条不能区分两型包虫病。进一步筛选出针对细粒棘球蚴或多房棘球蚴抗原的特异性单克隆抗体,以此制备可区分检测囊型包虫病和泡型包虫病患者血清循环抗原的胶体金免疫层析试条是今后的研究方向。

利益冲突：无

引用本文格式：张璟,王颖,高春花,等.检测棘球蚴病患者血清内循环抗原的免疫层析试条的制备和评价[J].中国人兽共患病学报,2024,40(2):166-170. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.021