酶促挤压对藜麦理化性质的影响

范金旭， 王 静， 薛 玉， 周中凯

（天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457）

藜麦（Chenopodium quinoa）原产于南美洲安第斯山脉地区，在当地有7000 余年的种植历史，是印第安土著的传统食物[1-2]。 与其他谷物相比，藜麦氨基酸组成丰富，联合国粮食及农业组织（FAO）推荐藜麦为可以满足人体全部基本物质的完美营养食物[3]。藜麦不含麸质，升糖指数较低（GI 为35 左右），老人、小孩及高血糖、高血脂人群均可食用[4-6]。

藜麦的外壳中存在一种被称为皂苷的糖苷化合物，皂苷味苦，食用前需要除去[7]。 传统的皂苷去除方法是把藜麦浸泡在自来水中互相搓洗，但是这种方法耗水量大[8]。 而挤压膨化作为一种熟化的处理方式，可以有效降低藜麦中的皂苷[9]，但也会对其中的酚类等生物活性物质造成破坏，会在挤压膨化过程中由于高温、 高压和高剪切力的作用发生分解、脱羧以至于受到破坏，某些酚类物质和单宁类物质也会发生聚合， 导致相应的抗氧化能力下降。Zeng 等优化了挤压过程中的变量[10]，如温度、螺杆转速、水分质量分数，目的是使挤压产品获得理想的口感和物理化学特性。耐高温α-淀粉酶是一类催化α-1，4 糖苷键水解的淀粉水解酶，是现已广泛应用于食品工程的酶。1980 年以来就有研究人员将耐高温α-淀粉酶应用于挤压膨化处理，目的是当挤压机作为生物反应器时获得更好的淀粉液化效果。2004 年Van 等通过在挤压过程中添加耐高温α-淀粉酶，发现加酶挤出样品的流变学特性会因为酶的作用而发生变化[11]。Xu 等发现在糙米以及大米挤压过程中添加耐高温α-淀粉酶对总酚起到保护作用[12]。

由于藜麦在我国种植时间不长，并且其中的皂苷会对口感产生不利的影响，导致国内对藜麦产品精深加工较少。作者探讨了添加耐高温α-淀粉酶对挤压膨化产物的理化性质以及酚类物质的影响，在挤压膨化的过程中保护了藜麦中的活性物质。 而耐高温α-淀粉酶与挤压工艺耦合处理也是微生物发酵的一种很好的前处理方法，为后续藜麦的微生物发酵产品提供了途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红色藜麦：安第优谷（厦门）商贸有限公司；高温α-淀粉酶：诺维信（中国）投资有限公司；无水甲醇、福林酚、没食子酸（GAE）等：上海源叶生物科技有限公司；碳酸钠、盐酸、醋酸钠等：均为分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SLG30-IV 双螺杆试验机： 山东赛百诺机械有限公司；FW100 高速磨粉机： 天津泰斯特仪器有限公司；US1510 扫描电子显微镜： 捷克泰思肯仪器公司；Bettersize 2600 激光粒径分析仪：丹东百特仪器公司；IS50 傅里叶红外光谱仪： 赛默飞世尔科技公司；TechMaster2 快速黏度分析仪： 瑞典Perten 仪器公司；Epoch2 酶标仪： 美国Thermo 公司；1260 InfinityⅡ高效液相色谱仪、 色谱柱HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm×0.25 um）： 美国安捷伦科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备 利用高速磨粉机将藜麦进行破碎并过40 目筛得到藜麦粉。 用双螺杆挤压膨化机对藜麦粉进行处理， 挤压参数参照张婷等的方法[13]并略作修改，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ区挤压温度分别为70、90、110、140 ℃；调节水分至质量分数20%；螺杆转速为25 Hz。膨化后的藜麦用高速磨粉机进行破碎，过60 目筛得到挤压膨化的藜麦粉。 酶添加量参照Xu 等的方法[12]并略作修改，添加质量分数为0、0.05%、0.10%、0.30%、1.00%。 其中未处理样品记为RAW、传统挤压样品记为TE、酶联挤压处理样品根据酶浓度记为EE-0.5、EE-1、EE-3、EE-10。

1.3.2 挤压对吸水性、水溶性指数的影响 参照冯飞等的方法并稍作修改[14]，称取1 g 样品（W0）至恒重的离心管（W1）中，加入10 mL 蒸馏水，搅拌至样品完全分散，置于30 ℃水浴保温30 min，每10 min振荡一次。 保温结束后以3000 r/min 转速离心15 min，将上清液倒入恒重的平面皿（W2）中，烘干称质量（W3），将离心管和下层沉淀称质量（W4）。 计算公式如下：

式中：IA为吸水性指数，%；IS为水溶性指数，%；W0为样品质量，g；W1为离心管质量，g；W2为平面皿质量，g；W3为烘干后平面皿质量，g；W4为离心管和下层沉淀质量，g。

1.3.3 挤压对微观结构影响 参照肖悦等的方法并稍作修改[15]，采用扫描电子显微镜（SU1510）观察藜麦样品的微观结构。 将样品进行喷金处理，之后在40 kV 下进行观察。

1.3.4 挤压对粒径的影响 参照Liu 等的方法并稍作修改[16]，使用激光粒径分析仪（Bettersize 2600）测定，将样品分散在搅拌池中，设定循环泵转速为1600 r/min，遮光范围10%～15%，检测结果由仪器专用软件对结果进行分析。

1.3.5 傅里叶红外光谱分析 参照Blan 等的方法并略作修改[17]，使用傅里叶红外光谱仪（IS50）进行测定，将1 mg 样品与150 mg KBr 于研钵中研磨，充分研磨后置于红外光谱仪，扫描范围为4000 cm-1～500 cm-1，共扫描32 次，分辨率为4 cm-1。

1.3.6 快速黏度分析 参照郑排云的方法并稍作修改[18]，将3 g 样品与25 mL 蒸馏水在铝制罐中混合，待样品完全分散后使用快速黏度分析仪进行测定。 仪器按照如下程序运行，50 ℃保持1 min，以恒速上升到95 ℃（3.8 min），保持2.5 min，再以恒速下降到50 ℃（3.8 min）， 保持1.4 min。 搅拌器在起始10 s 内转速为960 r/min，之后保持在160 r/min。

1.3.7 挤压对总酚、总黄酮质量分数以及抗氧化能力的影响 酚类提取： 参照Yu 等的方法并略作修改[19]，将0.2 g 样品放置于10 mL 离心管中，加入5 mL 甲醇，在50 ℃下超声提取90 min，将混合物在4 ℃以10000 r/min 离心10 min， 收集上清液作为游离酚提取液。 向残留物中加入5 mL 的4 mol/L NaOH 溶液，30 ℃在220 r/min 摇床中水解4 h，将混合物在4 ℃以10000 r/min 离心10 min， 收集上清液于50 mL 离心管中， 用6 mol/L HCl 溶液将上清液的pH 调至1.5～2.0，并用10 mL 乙酸乙酯萃取结合的酚类化合物，萃取3 次。 将萃取液在35 ℃下旋转蒸发干燥后，向烧瓶中加入5 mL 甲醇，超声处理以溶解提取物，所得提取物为结合酚，与先前提取的游离酚混合后作为总酚提取物在-20 ℃储存备用。

总酚质量分数的测定：参照李静等的方法并略作修改[20]，取200 μL 酚类提取液加入200 μL 的0.25 mol/L 福林酚试剂，避光反应3 min，加400 μL质量分数15%Na2CO3溶液进行中和反应，25 ℃保温30 min， 在760 nm 处测定吸光度， 并以没食子酸（GAE） 制作标准曲线：y=12.949x+0.2671 （R2=0.993）。 样品以每克干质量样品中没食子酸的质量分数表示。

总黄酮质量分数的测定：参照高秀印等并略作修改[21]，取200 μL 酚类提取液加入100 μL 的5 g/dL NaNO2溶液。反应6 min 后加100 μL 质量分数10%Al（NO3）3溶液。静置6 min，加800 μL 质量分数4%NaOH 溶液，继续静置15 min，在510 nm 处测定吸光度， 并以芦丁（CE） 制作标准曲线：y=0.8725x+0.0528（R2=0.998）。 样品以芦丁质量分数计（mg/g）。

ABTS 自由基清除能力的测定： 参照Ti 等的方法并略作修改[22]，将7 mmol/L ABTS 溶液与2.45 mmol/L K2S2O2溶液以体积比1∶1 混合， 反应12～16 h，制成ABTS＋储备液。使用前，用甲醇稀释25 倍，使其在734 nm 处的吸光度为0.70±0.02。将200 μL 酚类提取物与3 mL ABTS＋储备液混合6 min， 在734 nm 处测定其吸光度， 并以水溶性维生素E 制作标准曲线，标准曲线为：y=-0.95x+0.678（R2=0.998）。结果以水溶性维生素E 质量摩尔浓度表示（μmol/kg）。

铁氰化钾法（FRAP）总还原能力的测定：参照Xu 等的方法并略作修改[12]，将300 mmol/L 乙酸钠缓冲液（pH 3.6）、10 mmol/L TPTZ 溶液和20 mmol/L FeCl3溶液以体积比10∶1∶1 混合配制FRAP 工作液。取10 μL 酚类提取液， 加入1 mL 预热过的FRAP工作液，37 ℃反应5 min，在593 nm 处测定吸光度。并以水溶性维生素E 制作标准曲线， 标准曲线如下：y=0.2531x+0.1026（R2=0.999）。结果以水溶性维生素E 质量摩尔浓度表示（μmol/kg）。

DPPH 自由基清除能力测定：参照Yu 等的方法并略作修改[23]，将0.25 mL 酚类提取物加入3.75 mL甲醇中， 然后加入1 mL 的0.2 mmol/L DPPH·至甲醇溶液中，避光反应30 min，在517 nm 处测定其吸光度，并以水溶性维生素E 制作标准曲线，标准曲线为：y=-0.4608x+0.6354（R2=0.998）。 结果以水溶性维生素E 质量摩尔浓度表示（μmol/kg）。

1.3.8 挤压对酚酸含量的影响 总酚的提取参考Ge 等的方法[24]并略作改动，将10 g 样品用甲醇超声提取90 min 后离心取上清液，重复提取3 次，将提取液在45 ℃旋转蒸发干燥后， 用水溶出并真空冷冻干燥得到酚类提取物。 将酚类提取物溶于色谱级甲醇并过0.22 μm 微孔膜。

HPLC 测定酚类化合物参考Cai 等的方法并略作改动，采用Apollo C18色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm），流动相A 为体积分数1%冰乙酸，流动相B为色谱级无水甲醇[25]，洗脱程序：体积分数90% A和10% B（0 min）、65% A 和35% B（30 min）、50%A 和50% B （55 min）、40% A 和60% B （60 min）、90% A 和10% B（65 min）、90%A 和10%B（70 min），进样量为10 μL，流量为0.6 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为280 nm。

1.4 数据处理

采用Origin 2018 以及SPSS 22 对实验数据进行处理及统计分析， 显著性差异水平为P＜0.05，所有实验均重复3 次。

2 结果与分析

2.1 挤压对吸水性、水溶性指数的影响

吸水性指数（IA）和水溶性指数（IS）可以描述挤压产品的分子损伤程度，是微生物发酵的关键[26]。由表1 可以发现，样品的IA，经传统挤压后由2.02 上升至4.84，经加酶挤压后随酶浓度的增加从4.52 下降至3.19。 样品的IS，经传统挤压后由0.13 下降至0.08，经加酶挤压后随酶浓度的增加从0.11 上升至0.29。 挤出物的IA反映了淀粉的持水能力，TE 的IA最高，这可能是由于淀粉在挤压过程的高温、高压和高剪切力下， 降解为大量亲水基团的糊精分子。随着酶浓度的增加，EE 的IA降低。 证明酶促进了淀粉的水解，产生了更多的可溶性小分子物质。 TE 的IS降低约一半， 而随着酶浓度增加，EE 的IS从0.11逐渐升高到0.29。 EE 的IS上升主要是因为样品大分子物质降解为大量可溶性小分子物质。 并且这种IS升高的现象会影响挤出物的抗氧化性能， 因为样品中一些美拉德产物（MRP）是由氨基酸与酶解产生的还原糖作用生成的， 而这些水溶性MRP 具有抗氧化性[27]。

表1 藜麦样品吸水性和水溶性指数Table 1 Water-absorption and water-soluble index of quinoa samples

2.2 挤压对微观结构的影响

藜麦淀粉颗粒相较于其他来源的淀粉颗粒较小，当放大倍数为500 倍时，由图1（a）可看出藜麦淀粉呈球形和椭圆形的团聚体，与文献报道一致[28]。当放大倍数达到3000 倍后由图可以清楚观察到淀粉颗粒表面， 可观察到RAW 样品边缘光滑具有完整的结构。 而挤压处理后当放大倍数为500 倍时，由图1（b）～（f）可以看出，淀粉颗粒以相对较大的颗粒结合在一起，放大3000 倍后，由图1（h）可以看出TE 样品表面有裂痕，EE 样品形状与TE 相似。挤压过程中样品的不同物质发生聚集，导致挤压处理后样品颗粒变大，由图1（i）～（l）可以看出挤压过程中在酶解作用下，淀粉发生水解导致颗粒表面有大量孔洞[26]，结构和形态发生了很大的改变，变得更为松散。

图1 藜麦样品的扫描电镜图Fig. 1 Scanning electron microscopy of quinoa samples

图2 藜麦样品的粒径分布图Fig. 2 Particle size distribution of quinoa samples

2.3 挤压对粒径的影响

由表2 可以发现，挤压样品其D10、D50、D90、D[4，3]都明显高于RAW 样品。 RAW 样品有2 个峰，其中第一个峰主要对应于单个淀粉颗粒的存在，第二个峰主要对应淀粉、 蛋白质等物质组成的聚集颗粒的存在。 而挤压处理后的样品都只有一个峰，这是因为样品经挤压处理其蛋白质、淀粉等物质发生粘连。 虽然淀粉被酶水解成小分子， 但是在挤压过程中还是发生了粘连，所以EE 样品的D[4，3]、D10、D50、D90依然明显高于RAW，与电镜观察得到的结论一致。

表2 藜麦样品粒径Table 2 Particle size of quinoa samples 单位：μm

2.4 傅里叶红外光谱分析

FTIR 对短程分子水平上的结构变化很敏感，不同酶添加量的FTIR 光谱如图3 所示。 RAW 的红外光谱图在3432 cm-1处观察到单一强吸收峰， 对应淀粉分子中O—H 的伸缩振动。 分别在2926 cm-1和2855 cm-1附近观察到不对称的—CH 伸缩和对称的-CH 伸缩。此外，羰基和H—O—H 伸缩分别在1743 cm-1和1654 cm-1附近清晰可见[27]。 然而TE和EE 的FTIR 光谱图与RAW 基本相同。

图3 藜麦样品的傅里叶红外光谱图Fig. 3 Fourier infrared spectrum of quinoa samples

FTIR 光谱已被用于在分子水平上探索淀粉结构的短程有序性。 1022 cm-1和1045 cm-1的吸收带分别与非结晶区和结晶区相关，所以可以用A1045/A1022来表示淀粉的短程有序程度[26]。RAW 样品的比值最高，但经传统挤压后其比值下降，由0.85 下降到0.77。 这说明挤压处理使得淀粉发生糊化，结构受到破坏，淀粉短程有序性下降。 而挤压过程中酶的加入使得比值再次明显下降，说明酶的加入使得淀粉发生水解，其结构发生更加剧烈的变化，与电镜观察得到的结论一致。

2.5 快速黏度分析

RVA 可以模拟样品的蒸煮过程，是一种重要的分析样品糊化特性的方法。 不同处理样品RVA 黏度曲线见图4。样品经热处理后的黏度均显著降低。经TE 处理后的样品峰值黏度由822 降低至288，经EE 处理后的样品峰值黏度随酶质量分数的提高逐步降低至32。 经TE 处理的样品最终黏度由551 降低至331， 经EE 处理的样品最终黏度随酶质量分数的逐步提高降低至10。 样品经TE 处理后黏度不仅下降，峰也发生前移，同时糊化温度降低，这是因为挤压处理过程中淀粉发生糊化，淀粉颗粒遭到破坏，一部分直链淀粉暴露，淀粉吸水膨胀能力减弱，进而使得黏度下降。 一部分大分子聚合物被分解成小分子物质，导致其吸水膨胀能力下降，也会导致黏度下降。 最终由于在挤压处理过程中淀粉结构发生变化进而导致黏度降低[29]。EE 处理后黏度进一步下降，峰继续发生前移，糊化温度下降，这是因为高效的酶解作用加剧了淀粉的崩解，产生更多的小分子糊精[26]。 最终黏度的下降也说明酶解使得淀粉结构被破坏，与电镜观察到的结论一致。

图4 快速黏度分析曲线变化图Fig. 4 Rapid viscosity analysis curve

2.6 挤压对总酚、总黄酮质量分数及抗氧化能力的影响

样品总酚、 黄酮质量分数以及抗氧化能力（DPPH、ABTS、FRAP）的变化趋势与Xu 等的研究结果相似[12]。 由表3 可以看出，样品经TE 处理后多酚和黄酮质量分数分别由0.46%和1.58%降低至0.31%和1.07%；经EE 处理的样品多酚以及黄酮质量分数随酶浓度的升高而升高，至0.44%和1.45%，相较TE 处理的样品多酚以及黄酮质量分数更高。由于挤压是一个持续高温高压的状态，虽然可以通过打破细胞壁的基质和多酚复合物中的共价键来提高酚类物质的可及性，但是一些不稳定的酚类化合物会发生脱羧反应并且分解，其他的一些生物活性物质也会被破坏，所以样品的多酚以及黄酮质量分数有所下降[12]。 而EE 处理样品的多酚以及黄酮质量分数随酶浓度的提高而提高。 这是由于酶高效水解实现了淀粉的快速糊化与液化，使得原本恶劣的挤压环境得到改善， 减小了机械冲击和剪切力，因此酚类物质得到了保护[17]。

表3 总酚、总黄酮及抗氧化能力Table 3 Total phenols，total flavonoids contentand antioxidant activity

采用DPPH、ABTS 和FRAP 法测定样品的抗氧化性， 由表3 可以看出，TE 处理的样品比RAW 处理的样品其抗氧化能力要低，这与其他膨化谷物得到的结果一致[12]。 这是由于恶劣的挤压环境不仅使酚类物质受到损伤，还使得一些活性物质失活导致其抗氧化能力下降。 而相较于传统挤压，挤压过程中酶的加入，不仅保护了酚类物质，而且还保护了其他活性物质免受机械能冲击[17]。 而EE 处理的样品的抗氧化能力随酶浓度的升高而提高，最终超过RAW 的值， 这可能是由于挤压过程中氨基和部分还原糖会发生反应产生一些MRP，而其中一些水溶性MRP 具有抗氧化性导致的[12]。

2.7 挤压对酚酸质量分数影响

由表4 可知，样品中的8 种酚酸类物质呈现的变化趋势与总酚和黄酮质量分数测定的结果一致。对比不同的加工方式，TE 样品的酚酸质量分数最低， 相较TE 处理，EE 处理样品的酚酸质量分数有所提高， 在酶质量分数0.3%时，EE 处理使得阿魏酸、 芦丁以及没食子酸的保留量分别是TE 的200.8%、128.7%和443.7%。 虽然挤压过程中对结构的改变可能会使结合的酚酸随着细胞壁的破坏从细胞内释放出来，转化为游离形式，提高酚类物质的萃取性， 但是TE 样品的酚酸质量分数依旧会下降。 这说明传统挤压环境不利于酚酸的保留，不稳定的酚类化合物在挤压过程中会发生脱羧反应，而在挤压过程中酶的加入使得酚类物质得到了保护。这是因为酶的高效水解性，液化了挤压环境，但是挤压还是会使得除没食子酸和咖啡酸之外其他酚酸的质量分数下降， 这点与总酚测定的结果相同，而EE 样品中没食子酸、 咖啡酸质量分数高于未处理样品。 这是因为在酶的作用下酚-葡萄糖苷（共轭酚）中可能释放出酚酸[10]，会导致酚酸质量分数上升。

表4 藜麦样品中酚酸质量分数Table 4 Phenolic acid mass concentration in quinoa samples

3 结语

通过对藜麦不同处理组理化性质的测定分析，发现传统挤压会使藜麦中淀粉发生糊化和降解，结构发生破坏，导致其水溶性指数下降、吸水性指数上升、黏度下降、粒径变大、抗氧化性减弱，而酶促挤压处理的样品相较传统挤压处理的样品水溶性指数上升、吸水性指数下降、黏度下降、粒径变小、抗氧化性提高。 作者通过对其酚酸质量分数的测定发现，藜麦经传统挤压工艺后酚酸质量分数明显下降，而加酶挤压之后，由于酶的高效水解性能，其样品中淀粉实现了快速液化，从而改善了恶劣的挤压环境，使得酶促挤压中酚酸得到保护，质量分数有所提高。