p53 与肿瘤细胞糖酵解*

李超波，马向明，曹立瀛

063000 河北 唐山，华北理工大学附属开滦总医院 肝胆外科

作为一个拥有广泛而强大功能的抑癌基因，p53 一直是肿瘤学研究的焦点之一，在近乎半数的肿瘤患者中存在TP53基因突变，其中80%为错义突变，是迄今为止人类癌细胞基因组中发生突变频率最高的基因，突变型p53 不仅失去了肿瘤抑制功能还获得了新的致癌能力，被认为是癌症发生、发展和预后不良的重要环节［1］。作为“基因守护者”，p53 可以被DNA 损伤、癌基因激活、营养缺乏以及氧化应激等多种应激因素激活，从而启动对特定靶基因的转录和各种细胞反应的调控，包括细胞周期停滞、细胞凋亡和衰老等［2］。近十几年来，随着肿瘤代谢研究的深入，p53 对肿瘤的代谢调控功能受到越来越多的关注。

有氧糖酵解增强而氧化磷酸化减弱是肿瘤糖代谢重编程的一个重要特征，目的是通过满足肿瘤细胞对抗氧化剂和合成代谢物质的巨大需求来完成其发生、增殖及侵袭［3］。p53 完全缺失的小鼠可迅速导致自发性胸腺淋巴瘤的发生，但小鼠p53基因的DNA 结合域的三个乙酰化位点（K117、K161、K162）在同时被精氨酸取代后形成的p533KR/3KR突变小鼠却丧失了周期停滞、衰老和凋亡等经典功能，保留了抑制糖酵解和降低活性氧 （reactive oxygen species，ROS） 的能力，并且p533KR/3KR小鼠并没有发生自发性胸腺淋巴瘤等早发性肿瘤，表明p53 抑制糖酵解的能力对其肿瘤抑制作用的重要性［4］。通过对肝癌等12 种常见恶性肿瘤的6 039 个癌症基因组图谱（TCGA）数据库患者样本的DNA-Seq 数据进行泛癌分析发现，TP53突变最常见，p53 突变相关基因在糖酵解和mTORC 1 信号转导通路中富集，其中糖酵解相关基因己糖激酶（hexokinase，HK）2、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）P和丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）M与12 种癌症中的TP53突变显著相关［5］。大量研究显示p53 可通过其下游的一些靶点对抗Warburg 效应，从而抑制糖酵解并促进线粒体氧化磷酸化，对糖酵解关键酶的调控可能是p53 代谢调节能力至关重要的环节。此外，p53 家族的另外两个酶p63 和p73 在肿瘤中不经常突变，在p53 突变和缺失的肿瘤中，通过p63 和p73 来调控糖酵解也是目前的p53 替代策略之一［6］，因此，在本综述中也描述了p63 和p73 对糖酵解酶的调控作用。

1 P53 与HK2

HK 是糖酵解通路的第一个关键酶，可以把葡萄糖转化为葡萄糖6 磷酸，相当于糖酵解通路总“闸门”的作用，对糖酵解下游及磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway，PPP）的通量起着总的调控作用。因此，多种恶性肿瘤细胞通过表达高活性的HK2来满足快速增殖产生的能量和底物需求，并与肿瘤预后不良、分期进展、转移和治疗抵抗有关［7-8］，表明HK2 是一个有希望的癌症治疗限制目标。早在1997 年就有研究发现肝癌细胞中HK2 的启动子含有p53 反应元件，而突变型p53 可以通过与HK2启动子结合促进HK2 的表达来促进糖酵解［9］。与Li-Fraumeni 综合征相关的p53G245S 突变体在缺失p53 的H1299 细胞中表达会促进HK2等糖酵解基因的表达［10］，前列腺癌中肿瘤抑制基因PTEN和p53 的缺失会诱导HK2 表达［11］。而致癌物砷通过沉默调节蛋白1 介导的p53（K382）去乙酰化，促进了HK2 的表达，增加肝癌L-02 细胞糖酵解和增殖［12］。核糖体RNA 加工蛋白15 可以预防肝癌细胞的凋亡，这与p53 突变和缺失后HK2 表达增加导致的ROS 减少有关［13］。P53 激活剂SLMP53-1 可以下调人结肠癌细胞HCT116 中HK2 等糖酵解酶表达［14］。p53 还可以通过间接诱导miRNA-34a［15］和miRNA-143［11］的表达分别降低人结肠癌细胞和前列腺癌中HK2 mRNA 的转录。以上研究结果揭示，p53 可以抑制HK2 的表达，而某些突变型p53可以促进HK2 的表达。

与线粒体结合的HK2 可以促进糖酵解与氧化磷酸化之间的偶联并拮抗肿瘤细胞的促凋亡途径和化疗敏感性［7，16］。p53 是一种锌结合蛋白，需要锌离子来保持DNA 结合结构域的正确构象［17］，在前列腺癌中过表达p53 和锌可以增加HK2 的表达，但会通过AKT/GSK3β/电压依赖性阴离子通道（voltage-dependent anion-selective channel，VDAC）来破坏线粒体外膜上HK2 和VDAC 的结合，并释放促凋亡蛋白Bax 和Bak，从而引起线粒体膜通透性的变化，导致细胞凋亡［18］。此外，在低氧诱导的卵巢癌细胞中，p53 与HIF-1α 也协同介导了HK2 的活性和表达，p53 靶基因TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator，TIGAR）在HIF-1α的介导下被输送到线粒体并与HK2 形成复合体，增加HK2 的活性［19］，而核TIGAR也可以明显增加HK2 的表达［20］，但近期也有研究显示肾上腺素会导致T 淋巴瘤细胞中p53 的下调和HIF-1α上调，这增加了HK2 和PKM2 的表达，促进了肿瘤的进展［21］。因此，HIF-1α介导的低氧信号也能通过对p53 的调控来间接调控糖酵解通量，从而促进低氧条件下肿瘤细胞的存活。化疗药物的肿瘤耐药性是限制肿瘤药物疗效的一个重要原因，而p53 对HK2 的调控作用可以增加肿瘤药物化疗敏感性。p53 与顺铂分别单独处理，都能增加TIGAR的mRNA 和蛋白水平，但联合处理后会导致TIGAR在蛋白水平下降，这会减少线粒体上的HK2-TIGAR复合体，增加线粒体凋亡，提高肺癌细胞对顺铂的敏感性［22］。也有实验发现顺铂及二甲双胍也可以通过p53-HK2 轴减少HK2 的表达来保持卵巢癌的化疗敏感性［23］，这可能与p53 磷酸化后线粒体上HK2与凋亡诱导因子脱落导致的细胞凋亡有关［24］。因此，定位于线粒体上的HK2 将能量代谢与细胞凋亡相结合起来，而p53 是其中的关键调控分子，p53 介导的HK2 线粒体定位受损对促进肿瘤细胞凋亡及能量限制具有双重意义。

2 p53 和PFK-1

PFK-1 是糖酵解途径的第二个关键酶，目前的研究发现，它也是上游PPP 通路和下游糖酵解通路的重要十字路口。众多的关键分子也是通过调控PFK-1 的强激活剂果糖-2，6-二磷酸（fructose-2，6-bisphosphate，F-2，6-BP）来发挥对PFK-1 的调控作用。p53 对PFK-1 的多种调控通路可以帮助细胞应对不同的氧化应激与修复压力。其中，双功能酶6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-biphosphatase， PFKFB）分别通过其N-末端结构域和C-末端结构域催化F-2，6-BP 的合成和降解，因PFKFB3 和PFKFB4的激酶/磷酸酶比率较高，两者在癌细胞以及肿瘤相关细胞中过度表达［25-26］。多种应激信号可以激活p53 来调控PFKFB3 的表达。紫外线诱导的DNA损伤可以激活p53，通过抑制PFKFB3 表达来抑制糖酵解，并使葡萄糖中的碳源更多地进入PPP，以修复紫外线照射后DNA 的损伤［27］。而致癌信号激活肿瘤抑制基因CYLD后通过去除p53 的K63 和K48连接的泛素链来增强其活性并促进了p53 的核转位，促进了p53 与PFKFB3 启动子结合并抑制其转录，抑制了鼻咽癌肿瘤的生长和进展［28］。另外，缺氧48 h 的食管鳞状癌细胞能激活野生型p53 和突变型p53，但野生型p53 会抑制lncRNA AGPG，而后者会保护PFKFB3 免受蛋白酶体降解并激活糖酵解通量促进细胞周期进展，但突变型p53 会导致相反的效应［29］。近期有研究显示突变型p53 也会抑制PFK-1，谷氨酰胺缺乏后会导致胰腺导管腺癌细胞中的ROS 增加，激活突变型p53 并增强突变型p53 和miR-135 家族启动子之间的结合以增加其表达，最终抑制了PFK-1，导致糖酵解降低［30］，谷氨酰胺分解可以增加NADPH 和谷胱甘肽的产生［31］，而突变型p53 对PFK-1 的抑制可能通过增加PPP 通量来抵消谷氨酰胺的减少，这种机制是否只存在于严重依赖谷氨酰胺作为能量来源的细胞仍不清楚。此外，染色质免疫共沉淀实验表明肝癌细胞中PFKFB4基因转录起始点上游-4676 和下游+3247 存在p53 结合位点，表明p53 可直接抑制PFKFB4 的表达［32-33］。沉默PFKFB2 会导致ROS 的增加并通过JNK 来激活p53 诱导的凋亡，这可以增加具有野生型p53 卵巢癌和乳腺癌对紫杉醇的敏感性［34-35］。因此PFKFB 家族活性也是平衡糖酵解通量和PPP 途径之一，细胞中p53 的状态可能是决定这种平衡的重要因素。

p53 的另一个转录靶点TIGAR 与PFKFB3 的作用相反，p53 可以激活TIGAR 来限制PFK-1 的活性，增加PPP 通量，减少ROS 的产生，两者在细胞中产生串扰［36-38］，TIGAR 在急性淋巴细胞白血病体内和体外模型中均被证明可以抑制PFKFB3 的表达［39］。而在高糖诱导的心肌细胞中增加p53 乙酰化和TIGAR的表达，也可以拮抗PFKFB3的表达［40］。另外，在造血干细胞中过表达PFKFB3 可以特异性地拮抗p53-TIGAR 代谢功能，显著增加野生型p53造血干细胞中的ROS 水平［41］。因此，p53 对两者的调控是复杂的，PFKFB3 和TIGAR 的活性状态至少部分决定了p53 对糖酵解的调控水平，可以帮助细胞维持糖酵解的稳定性，但在p53 突变或缺失的肿瘤细胞中两者平衡的失调可以帮助肿瘤细胞增加糖酵解或应对ROS，因为在很多肿瘤中两者被上调或者下调［25，42-43］，对两者的同时调控也是治疗的靶点之一，但相关的药物研究仍然较少。

3 p53 和PKM2

PK 是糖酵解途径的最后一个关键酶，将磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转化为丙酮酸，其亚型PKM2 在胚胎或癌细胞等增殖细胞中高表达，而PKM1 通常在非增殖和终末分化类型的细胞中优先表达［44-45］。在之前的研究中表明PKM2 在携带野生型p53 的人结肠癌细胞株（RKO 和HCT116）和肺癌细胞株A549 中没有致癌作用［46］。但p53 突变后的功能获得会导致对PKM2 抑制作用的转变。双突变型p53（N340Q/L344R）通过促进PKM2 的表达、磷酸化及其聚合物的形成来促进肝癌发生［47］。而后续的另一篇研究中也发现p53 的R175H 和R273H 热点突变在哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的介导下显著增强了PKM2 Tyr105 的磷酸化，这可以稳定PKM2 的同源二聚体构象，促进了胰腺癌细胞的增殖［48］。但近期有研究发现PKM2（S100）的磷酸化会减少p53 突变的三阴性乳腺癌中的葡萄糖通量和血管生成［49］。因此，在p53 突变或缺失的肿瘤中，PKM2 可以作为肿瘤抑制的关键靶点之一，但需注意其磷酸化位点的不同。

PKM2 也可以双向调控p53。一方面，PKM2 可以通过蛋白-蛋白相互作用抑制p53 的表达。在HeLa、HCT-116 和HL-7702 细胞中过表达的PKM2可以直接与p53 及鼠双微粒体2（murine double minute 2，MDM2）结合形成三元复合体，促进p53的降解［50］，与此相似的是，最近有发现肺鳞状细胞癌的重要驱动基因FGFR 与其下游靶蛋白RACK1和FGFR/RACK1 复合物被发现既能促进PKM2 的表达，也能与MDM2 形成FGFR/RACK1/MDM2 复合物促进p53 的降解［51］。定位乳腺癌细胞核中的PKM2 被发现也可以与p53 蛋白发生相互作用，并抑制p53（Ser15）的磷酸化，使p53 丧失了周期阻滞能力［52］。来自酪氨酸的前5’tRNA 片段通过抑制PKM2 导致 p53 依赖性的神经细胞死亡可能也与p53（Ser15）的磷酸化相关［53］。与此一致的是，在非小细胞肺癌细胞和肝癌细胞中通过抑制PKM2 会导致p53 的上调，并随后引起细胞周期停滞和抑制肿瘤细胞生长［54-56］，在非肿瘤增殖细胞中也有相似表现［57］。PKM2 对p53 的调控与其核转位相关，而其介导的p53的抑制会导致p53肿瘤抑制功能的丢失，但在非肿瘤增殖细胞中这种调控更多的是解除p53对能量的限制而有益于细胞对能量的获取。但另一方面PKM2 对于p53 也存在促进作用。在DNA 损伤后，PKM2 反而增加了p53（Ser15 和Ser20）的磷酸化，并与淋巴特异性解旋酶形成复合物，抑制了MDM2 介导的p53 降解作用［58］。使用PKM2 激活剂TEPP-46 处理高血糖培养的HK-2 细胞，通过全基因组转录分析发现p53 信号通路的上调［59］。这种细胞之间调控的差异性存在着更多的潜在机制，而最近的另一篇研究提示这可能与PKM2 氧化还原状态有关，在PKM2 被TEPP-46 稳定在四聚体状态后可以与p53 结合并调控其转录活性，这种调控与PKM2 423 位半胱氨酸的氧化还原状态相关，氧化时抑制p53 表达，还原时促进p53 表达［60］。鉴于PKM2 对 p53 的双向作用，开发相关分子药物时必须了解潜在机制的差异性。

目前也发现多种抑癌药物可以实现p53 与PKM2 的调控作用。在乳腺癌细胞中，匹莫齐特通过抑制PI3K/Akt/MDM2 信号通路增加p53 的表达，进而下调PKM2 的表达，抑制了Warburg 效应［61］。而PKM2 对p53 的氧化还原依赖性差异调节对减少蒽环类药物导致的心脏毒性具有重要意义［60］。另外，在胃癌细胞中，大黄素被发现可能通过抑制ERK1/2-PKM2 通路诱导p53 的表达来抑制肿瘤进展［62］。肺癌细胞中菜蓟苦素可以通过抑制PKM2来促进p53 的上调，通过诱导周期停滞来抑制肿瘤的进展［54］。姜黄素对抗高糖诱导的化疗耐药被发现也与促进p53基因和抑制HK2、PFK1、GAPDH、PKM2、LDHA的基因表达有关［63］。因此p53 对PKM2 的抑制会导致糖酵解的降低，而PKM2 作为转录因子对p53 的调控可能更多地涉及到p53 的周期阻滞等经典功能，这种复杂的双向调控关系对药物的开发可能提出了更多的难度。

4 p63 和p73 对糖酵解关键酶的调控

p53 家族成员p63 和p73 主要存在两种亚型，与野生型p53 相似具有全长结构域的TA 亚型，以及与突变型p53 功能相似缺乏N 末端反式激活结构域的ΔN 亚型［64］。ΔNp63 和ΔNp73 经常在癌症中过度表达并且与恶性肿瘤的预后不良和治疗耐药相关［65-66］，而通过促进TAp63 和TAp73 的表达可以诱导肿瘤细胞的凋亡［6］。p63 可以调控葡萄糖的稳态［67］，而神经元细胞中TAp73 的缺失会增加糖酵解，ΔNp73 的缺失会降低糖酵解［68］。研究发现HK2基因组序列的第15 个内含子区域包含特异性的p63 增强子调控元件，ΔNp63 会显著增加人类角质形成细胞和乳腺癌细胞中HK2 的转录［69］。而在p53-/-的胸腺淋巴瘤中，抑制ΔNp63 和ΔNp73 可上调TAp63 和TAp73，并通过诱导胰岛淀粉样多肽（islet amyloid polypeptide，IAPP）来抑制HK2，从而抑制糖酵解，增加ROS 并激活细胞凋亡［66］。同时，在p53 突变或缺失的骨肉瘤细胞中，表达ΔNp63和ΔNp73 会抑制IAPP 的表达，从而促进葡萄糖摄取和细胞糖酵解［70］。IAPP 类似物普兰林肽也已被证实可导致p53-/-小鼠中的胸腺淋巴瘤和骨肉瘤消退［66，70］，但对胰腺癌并无抑制作用［71］。因此，在p53突变或缺失的某些肿瘤中，可以通过激活TAp63 和TAp73 来抑制HK2。但p63 和p73 对PFK-1 的调控仍存在较多争议。在ΔNp63 占主导的表皮胶质细胞中，PFKFB3 表达增加，促进细胞增殖，但会抑制细胞分化［72］。而在胰岛β细胞中，人IAPP 错误折叠蛋白会形成有毒寡聚体，会激活HIF-1α/PFKFB3 信号转导来促进糖酵解和非人类灵长类动物心衰模型中的心脏功能障碍［73-74］。而在多种肿瘤细胞中TAp73 通过上调PFK-1 亚型PFKL 和6-磷酸葡萄糖脱氢酶介导了Warburg 效应，但p63 并不会影响PFKL 表达［75-76］。因此，需要更多的研究来阐明p63 和p73 对PFK-1 的调控机制，而p63 和p73 对另一个糖酵解关键酶PKM2 的调控鲜有报道。目前也有多个p63 和p73 激动剂被报道在p53 突变或缺失的细胞中发挥抗肿瘤作用［6，77-78］。这些研究也表明葡萄糖代谢的调节可能是p53 蛋白家族的原始活动之一。总之，激活不容易突变的p63 和p73 来替代细胞中p53 突变或缺失后的糖代谢调节功能也是肿瘤抑制的策略之一，但这需要更多的研究来明确靶细胞中p63 和p73 亚型对肿瘤细胞存活的调控机制。

5 讨论与展望

综上可知，在三大糖酵解酶的众多亚型中，p53主要调控了HK2、PFK-1 以及PKM2 亚型，而这些酶的活性与肿瘤密切相关。p53 对糖酵解关键酶的调控在不断的研究中似乎正在变得逐步清晰，但置于整个代谢调控的背景中仍是复杂的［3］，且癌症的代谢是高度动态和异质性的，因此，通过p53 来系统性地调控糖酵解是有前途的治疗靶点，不过仍需明确细胞特异性机制改变，而针对p53 的多种抗肿瘤药物也在持续开发之中［79］，目前仍然没有临床应用的药物。但也有多种其他利用p53 活性的策略正在被尝试。例如，利用二甲双胍激活p53 抑制HK2 和葡萄糖氧化酶耗尽葡萄糖的原理构建了一种基于糖酵解抑制和葡萄糖剥夺的智能纳米药物［80］。而目前也发现多种非肿瘤抑制药物也能通过调控p53 或者其家族成员的活性来抑制肿瘤［23，61，70］。但某些肿瘤可能具有适应性地重新连接其他代谢途径的能力［81］。因此通过p53 抑制糖酵解通路与靶向谷氨酰胺等其他能量通路相结合也是有前途的策略之一。总之，本综述加深了我们理解肿瘤细胞中p53对糖酵解关键酶的调控作用，以期能寻找到更多的潜在机制及药物。

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