一种有效测量游离透明质酸钠含量的方法

朱吉，王娜，耿袁，顾颖涛，石磊

（江苏医路通检验检测技术服务有限公司，江苏张家港，215600）

0 引言

透明质酸钠是一种天然直链多糖，由（1 →4）-β-D-葡萄糖醛酸和（1 →3）-2-乙酰氨基-β-D-葡萄糖结合而成的双糖结构单元组成［1］。人体的各部位都有透明质酸的分布。早期美国的哥伦比亚大学教授Meyer 等［2］从牛眼玻璃体中提取出了透明质酸这一物质。透明质酸钠可用于眼科手术、关节腔润滑，以及预防术后组织黏结等［3］。天然的透明质酸钠具有良好的水溶性、保水性，可完全被生物降解［4］，但也因容易分散或被基体的酶分解而达不到较好的使用效果。引入交联剂可使链状的透明质酸钠交联形成网状结构，交联所得到的材料可在一定程度上克服上述天然透明质酸钠材料的缺陷，同时通过调节交联程度和工艺参数，可以获得具有适宜降解速度和适宜孔隙大小的材料，使产品具有更好的抗酶解性能和良好的流变学性能等，为人类更好地利用［5］。然而，交联的透明质酸钠难溶于水，致使对产品中未交联的游离透明质酸钠含量的测量不稳定，而有效测量游离透明质酸钠含量对产品的性能和应用起着关键作用［6］。现有方法测定游离透明质酸钠含量对于复杂基质往往不太稳定，受到各种因素的影响，导致前后测试结果差异极大，重复性低［7-9］。本文研究了一种新的方法，能够有效测定游离透明质酸钠含量，且重复性高、准确度可靠、回收率高、专属性强，可为工厂GMP 管理要求或者检验检测机构稳定性测试提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：紫外-可见分光光度计（赛默飞世尔科技，Evolution 350 PC）；分析天平〔赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，BSA224S〕；移液枪（Brand，1mL）

试剂：葡萄糖醛酸对照品（中国食品药品检定研究所，99.1%，批号140648-202005）；体积分数为0.125%的乙醇咔唑溶液；0.025mol/L 的四硼酸钠硫酸溶液。

1.2 实验方法

1.2.1供试品溶液制备

（1）取适量交联透明质酸钠凝胶于预先精密称重的容量瓶中，精密称定（精确到0.1mg），计算得凝胶质量记为m1。

（2）加纯化水定容至约容量瓶刻度的一半，将容量瓶置于旋涡混匀仪上混匀3min，后加纯化水定容至容量瓶刻度线，容量瓶中交联透明质酸钠凝胶和水的质量记为m2。

（3）将定容容量瓶中的液体经G3 坩埚式过滤器过滤，定量取1mL 上清液作供试品溶液。

1.2.2葡萄糖醛酸标准液系列溶液的制备

表1 葡萄糖醛酸标准溶液系列

1.2.3实验过程

将系列标准溶液和样品溶液试管一起放在冰水浴中。四硼酸钠硫酸使用前需在2～8℃冰箱内贮存至少2h，用移液器缓慢向每个试管中加入0.025mol/L 的四硼酸钠硫酸溶液各5mL，边加四硼酸钠硫酸边摇匀试管，加完后于沸水浴中煮沸15min 后取出，再在冰水浴中冷却，之后再向各试管内加入0.2mL 咔唑乙醇溶液，充分混匀后再次置于沸水浴中加热15min，等待冷却至室温。采用紫外可见分光光度计，以0 号（空白）管作为对照，依次测定各标准管和样品管在530nm 处的吸光度。绘制吸光度-浓度曲线，对照标准曲线，根据样品管的吸光度，算出样品管中葡萄糖醛酸含量。

1.2.4结果计算

按以下公式计算：

式中：ρ为透明质酸钠的质量浓度（mg/mL）；ρsam为样品管中葡萄糖醛酸含量（μg/mL）；m2为交联透明质酸钠凝胶和纯化水质量（mg）；ρ1为交联透明质酸钠凝胶密度，按1.01g/mL 计；m1为交联透明质酸钠凝胶质量（μg）；ρ2为交联透明质酸钠凝胶和纯化水混匀液密度，按1.00g/mL 计。

2 结果与讨论

2.1 线性关系

图1 透明质酸含量随吸光度变化的标准曲线

以透明质酸钠含量为横坐标，以相应浓度对应的吸光度为纵坐标，绘制浓度-吸光度曲线。在0～50μg/mL范围内，样品管中透明质酸钠含量与吸光度的线性较好，相关系数为0.9998。

2.2 精密度

参照《中华人民共和国药典》2020 年版第四部推荐的规定，待测成分含量为0～50μg/mL，RSD 为不大于5%。用至少6 份样品的游离透明质酸钠含量的检测结果计算相对标准偏差RSD。

表2 标准样品测试数据

采用标准物质c=21.38μg/mL，连续测试10 次，RSD 为0.02%（n=10）。

2.3 检测限和定量限

以《中华人民共和国药典》2020 年版第四部推荐的检测限测定方法，对空白溶液平行测定10 次，按照LOD=3.3s/k（s为标准偏差，k为线性方程斜率）进行计算，得方法检出限为 0.008 μg/mL。

最低检测限=3.3×测定空白值浓度的标准偏差，最低检测限= 3.3×0.002532=0.008（μg/mL）。

以《中华人民共和国药典》2020 年版第四部推荐的检测限测定方法［10］，对空白溶液平行测定10 次，按照 LQD=10s/k（s为标准偏差，k为线性方程斜率）进行计算，得方法定量限为 0.025 μg/mL。

定量限=10×测定空白值浓度的标准偏差，定量限=10×0.002532= 0.025（μg/mL）。

2.4 重复性

参照《中华人民共和国药典》2020 年版第四部推荐的规定，待测成分含量为0～50μg/mL，重复性为不大于5%。用至少6 份样品的游离透明质酸钠含量的检测结果计算相对标准偏差RSD。

同一批次样品测定10 次，RSD 为4.3%（n=10），见表3。

表3 样品测试数据

2.5 准确度（加标回收率）

参照《中华人民共和国药典》2020 年版第四部推荐的规定，方法准确度应在规定的线性范围内试验，一般用回收率表示。待测成分含量为0～50μg/mL，回收率限度为85～110%。用至少6 份样品的测试结果进行评价，用加标量为浓度含量与样品接近的标样进行试验。做10 次平行样，每次分别取1g 样品中和20mL浓度为53.46μg/mL 的标准溶液并加水定容至50mL，取1mL 按照1.2.3 试验过程进行试验，见表4。

表4 加标回收测试数据

同一批次样品加标回收测定10 次，平均加标回收率为94%（n=10）。

3 结论

目前，采用交联的透明质酸钠支架材料已开发为医疗产品，多用于骨科关节炎治疗、手术防粘连、软组织修复和美容整形填充，安全性和有效性已获得临床广泛的认可，但在组织工程领域的应用还不多。未来，随着应用的不断深入，游离和交联透明质酸钠含量的有效控制和测定要求也将进一步提升。游离透明质酸钠易溶于水，而交联透明质酸钠凝胶难溶于水，且需要溶解后才能将交联网络中的其他水溶性物质释放出来。为了减少交联透明质酸钠的干扰，减少测试过程中的各种偶然现象，提升游离透明质酸钠测量结果的准确性，本研究在已有研究方法的基础上，通过改变溶解方式和过滤模式，大大改进了测量方式，提高了测量的有效性。该方法可用于测量各种类型的交联透明质酸钠凝胶产品中的游离透明质酸钠含量。该测量方法具有准确度高、稳定性好、灵敏度高、重复性好等优点，专属性和适用性更强，可为标准的改进和工厂GMP 管理以及检验检测机构的测试提供参考。