精液品质相关基因在公牦牛血液中的表达研究

王耀梅，杨博璇，赵彦玲

（西藏农牧学院 动物科学学院，西藏 林芝 860000）

牦牛被称为“高原之舟”，是西藏特有的动物品种，促进着当地经济的发展[1]。据统计，我国现有1 600余万头牦牛[2]，是世界上拥有牦牛数量和品种类群最多的国家。娘亚牦牛是西藏自治区嘉黎县的优良牦牛品种，体型大、毛发多，其肉质富含多种矿物质、氨基酸和蛋白质，营养价值高。近年来，牦牛独特的遗传资源已成为研究热点。血液生理生化指标可以快速客观地反映牦牛机体的代谢水平和生理健康状况，是判断牦牛饲养管理水平的重要依据。大多数基因组生物的标记物是从侵入性程序里获得的组织中鉴定，如肝脏、乳腺、肾脏等。但在临床试验或临床筛选中，采取组织活检往往是不现实的。因此，通过采用相对较易获得的、具有代表性的一些组织，如血液、尿液、唾液等相关的分子标记。这意味着血液有利于对生物机制进行系统分析，逐步成为普遍使用的生物研究系统[3]。但还未见娘亚牦牛的相关报道，因此，本研究选取精液品质有显著差异的娘亚公牦牛为试验对象，研究相关基因在娘亚牦牛血液中的表达差异，旨在为娘亚牦牛的分子育种、早期选育和开发血液DNA标志物的相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验对象为饲养在拉萨市当雄县当雄牦牛冻精站的健康成年娘亚公牦牛。

1.2 试验材料

Trizol、反转录试剂盒、PBS溶液、Trans Start Eco Green qPCR SuperMix试剂盒、2×PCR Mix。

1.3 试验设计

用假阴道法采集精液，采精后立即进行精液品质检测，根据检测结果（表1）选取精液品质有显著差异的娘亚公牦牛，分为高品质组（3头）和低品质组（3头）。分别采集2组娘亚牦牛颈静脉全血各1份，将采集到的血液样本置于-80 ℃冰箱备用。

表1 娘亚牦牛精液品质分析

1.4 试验方法

1.4.1 引物设计与合成 研究表明，GAPDH是哺乳动物中最好的管家基因之一[4]，用于研究多种哺乳动物的基因表达。本试验选择GAPDH基因作为内参基因，根据NCBI数据库中牦牛HSPB1、PSMC5、PSMD8、UGP2、PSMB3、HSP90AA1和GAPDH基因的mRNA序列，应用Primer Premier 5.0软件进行荧光定量PCR的引物设计，南京擎科生物技术有限公司合成引物序列，引物信息详见表2。

表2 引物信息

1.4.2 实时荧光定量检测 采用Trizol方法提取血液样品的总RNA，根据反转录试剂盒说明书转录成cDNA，再进行实时荧光定量PCR检测。先对cDNA样品进行5倍梯度稀释，再对基因进行标准曲线扩增。PCR扩增体系（20 μL）：cDNA模板1 μL，2×TransStart Eco Green qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。扩增程序：50 ℃逆转录30 min，激活荧光信号；95 ℃预变性10 min；95℃变性20 s，56 ℃退火20s，72 ℃延伸20 s，40个循环；95 ℃、60 ℃、95 ℃各15 s做熔解曲线。每个样品重复3次，最后采用2-△△CT方法计算目的基因相对表达量。

1.5 统计分析

用SPSS 19.0软件中的单因素方差分析数据，试验结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。使用Sigmaplot 10.0软件对试验结果进行柱状图制作。

2 结果

通过对高品质组、低品质组娘亚公牦牛全血中6个精液品质相关基因的实时荧光定量PCR检测，发现这6个目的基因及内参基因（GAPDH）的扩增曲线均能依次起跳，熔解曲线为单一峰，可见没有特异性扩增，且扩增效率在90%以上，符合试验质量控制要求，可以用2-△△CT方法计算基因相对表达量。

如图1所示，HSPB1基因在高品质组娘亚公牦牛血液中的mRNA表达量显著低于低品质组，而PSMC5、PSMD8、UGP2、PSMB3、HSP90AA1这5个基因在高品质组娘亚公牦牛血液中的表达量显著高于低品质组。

注：H代表高品质组，L代表低品质组，*表示差异显著（P＜0.05）。图1 精液品质相关基因在高、低品质组娘亚公牦牛血液中的mRNA表达

3 讨论

血液能把分散在全身的组织调节连接起来，有研究表明，在一些组织中会表达的基因，有80%的可能性会在血细胞中表达[5]，因此血液具备更直接、更全面的代表各个性能特征的潜力。

HSPB1蛋白又称HSP27（或HSP25）[6]，目前有大量研究证实，HSPB1在细胞的氧化应激损伤方面发挥着一定保护作用[7-8]。HSPB1可以通过增加谷胱甘肽还原酶的活性和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶使谷胱甘肽保持还原状态，从而减少活性氧（ROS）的产生[9]。机体在低氧刺激下会出现血管增生等生理反应，以此增加血液氧气运输能力，而HSPB1对血管生成平衡具有重要调控作用[10]，以上研究提示，HSPB1在调控氧化应激水平中具有重要作用。PSMC5是泛素化蛋白识别和蛋白酶体转移的调控成分之一[11]。除了调节蛋白酶体功能外，越来越多的证据表明PSMC5通过与转录活性启动子的相互作用和共激活子的招募直接参与转录调控[12]。如有研究者发现在腺病毒感染过程中，PSMC5可以被招募到病毒转录因子E1A中，并能增强下游靶点的转录[13]。PSMC5可能与p53转录因子相关，并以一种与p53招募相关的方式被招募到p53响应性p21启动子中。然而，PSMC5在肿瘤尤其是CRC中的作用和功能尚未得到充分研究，而在本研究中，娘亚牦牛精子中PSMC5主要参与蛋白质的分解代谢过程，对其精液品质有一定影响，在血液中表达量不显著且关于这一方面的研究报道也少有研究。PSMB3是蛋白酶体20S核心微粒的重要组成部分，被发现与癌症有关，目前在牦牛中的相关研究较少。Blijlevens[14]等研究发现，蛋白酶体β3亚基在非小细胞肺癌的临床样品中过表达。李天然[15]的研究表明，PSMB3基因在雌性橘小实蝇性成熟时卵巢组织表达较高，利用RNAi沉默PSMB3之后，卵巢发育受阻导致繁殖力下降。Yi等[16]发现，由于免疫阻断PSMD8亚基可增加猪受精过程中的多精分化率，因此19S复合物的活性可能是猪受精过程中抗多精分化防御的速率限制因子。PSMD8亚基的确切功能尚不清楚。除了多泛素链识别，PSMD8可能通过与蛋白酶体相关的去泛素化酶相互作用参与底物去泛素化[17]或与具有去泛素化活性的19S非atpase亚基PSMD14相互作用。抑制去泛素化实际上可以通过促进底物蛋白质和共价连接的泛素标签的整体降解来增加蛋白酶体蛋白水解的速率[18-19]。Mitsuhiro等[20]的研究表明，PSMD8的部分缺失可以损害蛋白酶体的功能。因此，PSMD8是影响精子受精过程中的一个重要蛋白，但在本研究中PSMD8在血液中的表达量不显著，且关于这方面的研究报道也少有研究。UGP2是核苷酸糖代谢中必不可少的八聚体酶[21]。Perenthaler等[22]的研究表明，UGP2蛋白较短亚型的缺失，可以导致神经干细胞中功能性UGP酶减少，从而使糖原代谢改变、未折叠蛋白反应上调以及神经元过早分化。UGP2产物UDP-Glc是糖缀合物生物合成和半乳糖代谢所必需的，所以UGP2在细胞中占有核心地位[23]。有研究者[24]证明UGP2在肿瘤生长及其调控细胞代谢过程中起关键作用。而本研究中发现UGP2在高品质组的血液中表达量上调但不显著，主要参与代谢过程，可能通过代谢过程影响精子活力，对牦牛精子的繁殖繁育能力产生一定影响。HSP90AA1基因定位于染色体14q32.2，编码热休克蛋白90a(HSP90a)[25]。HSP90AA1参与其客户蛋白的操作、折叠、组装和降解，对其内部平衡至关重要，更重要的是许多HSP90AA1的客户蛋白参与肿瘤发病过程，因此HSP90AA1在调节癌细胞的生长和生存中发挥着重要作用[26]。本研究发现HSP90AA1表达水平在高品质组显著高于低品质组。

4 结论

本研究条件下，HSPB1基因在高品质组精液娘亚公牦牛血液中的mRNA表达量显著低于低品质组，而PSMC5、PSMD8、UGP2、PSMB3、HSP90AA1这5个基因在高品质组娘亚牦牛血液中的表达量显著高于低品质组。本研究结果可为研究娘亚牦牛血液中基因表达与精液质量的相关性提供基础资料，也为娘亚牦牛的分子育种、早期选育和开发血液DNA标志物的相关研究提供参考。