黑色素瘤SENP1蛋白质参与达卡巴嗪耐药性的探究

赵 蓓 施小琪 唐雪梅 程 石*

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院(电子科技大学附属医院)皮肤科(皮肤病性病研究所),成都 610000;2.成都中医药大学医学与生命科学学院,成都 610000)

黑色素瘤是一种由黑色素细胞恶性病变导致的皮肤癌症,并且已经成为男性癌症发病率增长最快及女性发病率增长第二快的癌症[1]。据统计,2020年全球范围内新增皮肤黑色素瘤患者324 635例,其中死亡57 043例[2]。如在发病早期完成诊断,大多数黑色素瘤是可以治愈的。而一旦黑色素瘤发生转移,则预后较差,死亡病例甚至占到皮肤癌导致的死亡病例的80%以上[3]。晚期患者中位生存期仅为7.5个月,2年生存率约为15%,5年生存率仅为5%[4]。

针对早期皮肤黑色素瘤,外科手术是主要的治疗手段,但是对于中晚期黑色素瘤患者,化学药物治疗(以下简称化疗)等辅助治疗或姑息性治疗是改善预后的重要手段。其中,达卡巴嗪(dacarbazine,DTIC)是经美国食品药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的治疗晚期黑色素瘤的常规化疗药物[5]。即便如此,由于内在抗性或细胞抑制药物导致黑色素瘤的耐药性,目前化疗效果不佳。耐药性是限制化疗治疗恶性黑色素瘤疗效的主要问题;如果能够减少耐药,患者生存率可能提高。因此,研究黑色素瘤的耐药机制成为解决问题的关键。

Huang：Think carefully.Xi’er will have a happy life.

为进一步发掘与黑色素瘤耐药性相关的基因及信号通路,阐明其耐药机制,本研究以A375、M14黑色素瘤细胞为研究对象,通过逐渐提高DTIC浓度获得耐药性黑色素瘤细胞株[6],随后通过转录物组学,分析黑色素瘤细胞出发株及耐受株,获得发生显著差异表达的类泛素特异性蛋白酶1(SUMO-specific protease 1,SENP1)基因及信号通路,最后通过对相关基因的过表达及抑制,发现了其与黑色素瘤耐药性的相关关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂与仪器

1.1.1 细胞株

本实验使用A375、M14细胞株,由四川省人民医院实验室自行保存。

1.1.3 仪器

以A375、M14黑色素瘤细胞为对象,从初始诱导剂量2 μg/mL的DTIC处理处于对数生长期的A375、M14细胞培养24 h后换培养液,待其长至70%～80%密度时,再次加入2 μg/mL DTIC,同时开始成倍增加药物诱导剂量,每个剂量培养10 d。出发细胞株为本实验的对照组(A375-WT及M14-WT),最终获得的耐药性细胞株为本实验的实验组(DTIC-resistant,DR)。

1.1.2 试剂

第一，外校考入本校研究生在本科阶段只学习了工程热力学和传热学等基本课程，缺乏对燃气轮机专业知识的学习，导致入学之后学习我校研究生课程存在一定的困难，在课程结束之后也很难进入研究课题。第二，研究生入学后，以导师研究方向选择相应的课程和开展相关课题研究，学生毕业之后只熟悉自己的研究领域，不了解燃气轮机其他研究方向的内容。燃气轮机的设计是一个团队协作的工作，因此很难有效开展研究。第三，缺乏系统深入的了解，燃气轮机整体性能知识储备不足，不能满足研究生阶段及其参加工作后对于燃气轮机系统分析的需要。

在对A375及M14黑色素瘤细胞株连续添加DTIC培养(详见方法部分)8个月后,本研究对两株实验组细胞(DR)与出发株(对照组,WT)的耐受性进行了比较。首先,本研究测定了各细胞株对DTIC的半抑制浓度(the half maximal inhibitory concentration,IC50)。如图1A所示,经过8个月的处理后,无论A375还是M14黑色素瘤细胞株,其对DTIC的耐受能力都显著增加。其中,A375耐受株(A375-DR)相比对照组(A375-WT),IC50从(22.5±2.1)μmol/L提升至(138.4±1.7)μmol/L(P<0.001);而M14耐受株(M14-DR)相比对照组(M14-WT),IC50从(27.3±2.3)μmol/L提升至(167.4±2.2)μmol/L(P<0.001)。随后,本研究测定了耐受株与对照组在DTIC处理下的细胞凋亡情况。如图1B及1C所示,在10 μg/mL DTIC处理48 h后,A375-DR相比A375-WT以及M14-DR相比M14-WT,活细胞数量明显增加而凋亡细胞量均明显减少。以上结果表明,本研究成功获得了耐受DTIC的黑色素瘤细胞,同时也表明DTIC的长期使用可使得黑色素瘤细胞产生耐药性。

本研究所建立的青皮药材的HPLC指纹图谱，可反映药材样品的特异性和整体性信息。在11个共有峰中，通过与对照品HPLC图谱比对指认出了橙皮苷峰。10批药材样品的相似度评价结果表明，各批药材样品间质量存在差异。各共有峰相对保留时间的RSD差异小，但相对峰面积的RSD相差较大，提示不同产地药材样品的成分虽一致，但含量差异较大，这可能与药材的生长环境、采收季节、加工炮制等因素有关。

1.2 方法

采用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。将对照组及实验组细胞接种于24孔板(5×104个细胞/孔),分组培养48 h后收集细胞(1 000 r/min离心5 min),磷酸盐缓冲液洗1次后加入100 μL Annevix Binding Buffer重悬,依次加入5 μL Annevix FITC及5μL PI,室温避光15 min。上机前补加150 μL Annevix Binding Buffer后进行凋亡检测。

本研究所用主要试剂包括:DTIC(D129847,阿拉丁,中国)、Annexin V-APC/PI细胞凋亡检测试剂盒(HR8284,百奥莱博,中国)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,D8371,索莱宝,中国)、脱脂奶粉(D8340,索莱宝,中国)、Tris-HCl-NaCl-Tween(TBST)缓冲液(T1081,索莱宝,中国)、磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline,PBS)(P1022,索莱宝,中国)、放射免疫沉淀试验缓冲液(radio immunoprecipitation assay buffer,RIPA)(R0020,索莱宝,中国)、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(M128783,阿拉丁,中国)、四甲基乙二胺(TEMED,T105496,阿拉丁,中国)、过硫酸铵(A112450,阿拉丁,中国)、考马斯亮蓝(B104241,阿拉丁,中国)、SYBR qPCR Master Mix(Q711,诺唯赞,中国)。

1.2.2 细胞凋亡检测

1.2.1 黑色素瘤耐药细胞株的构建

国有农场办社会职能改革和农垦国有土地使用权确权登记发证任务基本完成。全国35个垦区中，21个垦区已全面完成国有农场办社会职能改革。全国农垦国有农场中已完成办社会职能改革任务的超过80%。公检法、基础教育机构、基本医疗和公共卫生机构等三项改革任务已基本完成。农垦国有土地确权率、发证率基本达到预期目标。

1.2.3 转录物组学分析

将成功建立的黑色素瘤野生型和耐药型细胞株用4℃预冷的1×PBS漂洗细胞2～3遍,加入Trizol。将样本送公司进行RNA测序(华大基因,中国)。将结果进行两组间基因表达水平分析、新转录本预测、GO/KEGG富集分析、蛋白质互作网络分析、基因共表达网络构建,从而得到耐药后黑色素瘤RNA转录水平变化的结果。用Trizol(Invitrogen)从骨髓间充质干细胞中分离总RNA。cDNA文库使用BGISEQ-500平台(华大基因,深圳,中国)进行扩增和测序。使FastQC(版本0.11.8)检查原始测序读数。通过Cutadapt(v2.0)对适配器修剪和低质量滤波进行分析,得到干净的数据。采用featurets(v1.6.0)软件对基因表达进行量化,采用DESeq2(R版本3.3.2)软件创建处理组间差异表达基因。采用折次变化临界值≥1.5,调整P值≤0.05。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)分析

古人有诗云：“绿蚁新醅酒，红泥小火炉，晚来天欲雪，能饮一杯无？”严寒冬日的晚上，无论是约三五好友，还是独自一人，守着热气腾腾的火锅，喝两杯小酒，那都是一件心旷神怡的事情。不过，吃火锅可绝对不是中国人的专利，在外国许多地方也是有火锅的，而且五花八门，各具特色，非常有意思。

在黑色素瘤细胞裂解液中,加入YAP蛋白质单克隆抗体,混旋仪4 ℃孵育过夜,加入适量PierceTMProteinA/G Magnetic Beads,置于4 ℃混合仪,旋转孵育2～4 h。将离心管置于磁力架上,静止1～2 min,待所有磁珠吸附于磁力架上,弃上清。加入4 ℃预冷的NP-40蛋白裂解液去除磁珠上未结合的蛋白质,弃上清。加入100 μL 1×loading buffer重悬管中的磁珠。混匀,煮沸10 min,冷却。将离心管置于磁力架上,静止1～2 min,待所有磁珠吸附于磁力架上,取上清进行WB,SUMO一抗孵育全膜,检测SUMO化修饰。

1.2.5 蛋白质印迹法(Western blotting,WB)

采用WB检测不同处理因素对A375细胞蛋白质水平的影响。收集不同处理因素的细胞,使用RIPA强裂解液进行裂解,提取总蛋白质,采用超微量紫外-可见分光光度计测定蛋白质浓度;每个样品取50 μg总蛋白质经电泳、转膜[聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜]后用5%(质量分数)脱脂奶粉/洗膜缓冲液(TBST缓冲液)室温摇床封闭1 h,一抗结合4 ℃冰箱过夜;TBST洗涤3次后进行二抗结合并在室温摇床孵育1 h,TBST洗涤3次;加入增强型化学发光试剂(enhanced chemiluminescence,ECL),显色1.5～2 min,采用凝胶成像系统观察结果。

HCC AM伴IVCTT患者临床可表现为腰痛。影像学表现可表现为肾上腺区占位伴随下腔静脉内充盈缺损，而缺乏肝脏原发肿瘤的表现。或者肾上腺转移瘤与肝脏病变分界不清。当影像学检查同时发现肝脏病变和肾上腺病变时，常不易辨别原发灶与转移灶。泌尿系增强CT或MRI亦有误诊可能。诊断的金标准为活检或手术切除后的病理确诊。患者既往史多有病毒性肝炎感染病史。

1.3 SENP1基因敲除细胞系构建

本研究使用第三代慢病毒包装体系,在HEK293T细胞系中包装,经过表达鉴定之后,使用0.1 mg/L PEG 8000浓缩,之后按照体积比1∶100加入病毒液和polybrene (8 μg/mL)感染黑色素瘤细胞。感染后12 h更换培养基。48 h后换入含puromycine的新鲜培养基,筛选14 d建立稳定表达细胞系。所有细胞经过WB检测YAP蛋白(Yes associated protein,YAP)的含量。

1.4 SENP1对YAP的SUMO化修饰

采用RT-qPCR对对照组和实验组中的目标基因的mRNA水平进行验证,检测是否符合转录水平的变化。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 DTIC处理8个月后显著提升了黑色素瘤细胞的耐药性

多功能微孔板检测仪(Synergy HTX,Biotek,美国)、凝胶成像系统(ChemiDocTMXRS+,Bio-rad,美国)、流式细胞仪(FACSCalibur,BD Biosciences,美国)、实时定量PCR仪(QuantStudioTM3 Real-Time PCR System,ABI,美国)。

图1 黑色素瘤耐受性细胞株与对照组的差异

2.2 转录组分析揭示类泛素特异性蛋白酶SENP1在耐药细胞株中表达量提升

为进一步发掘DTIC耐受细胞中参与耐受机制相关的基因及信号通路,本研究针对耐药型的黑色素瘤细胞系A375-DR、M14-DR以及对照组A375-WT及M14-WT进行了转录物组学分析(各包含3个生物学重复)。如图2A所示,转录物组学分析发现,相比对照组,黑色素瘤耐药性细胞株中有51个显著上调及61个显著下调的基因(fold change≥2,P<0.05)。类泛素蛋白质修饰分子(small ubiquitin-like modifier,SUMO)是一类小泛素样蛋白质修饰物。其中,SENP1是泛素化和去泛素化过程中所需的关键蛋白酶,影响细胞周期、细胞增殖和凋亡状态,也是研究最深入并与肿瘤密切相关的SUMO化蛋白酶[7]。之前已有报道[8]表明SENP1与黑色素瘤的发生相关,而本文研究转录物组学结果发现,SENP1在耐受细胞株中发生了显著上调(图2A红色箭头所示)。通过京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析对差异基因进行聚类分析,发现差异基因聚集于多个代谢途径(图2B)。其中,Hippo信号通路参与调控细胞生长、增殖、存活、迁移、分化等关键过程,在器官发育和内环境稳态的维持中发挥着重要作用[9]。其中,Hippo信号通路的关键基因YAP在DTIC耐受细胞株中同样出现显著上调。Vittoria等[10]发现Hippo抑制通路的失活可促进黑色素瘤发展。而在笔者团队先前的研究[11]中,也发现YAP的激活有助于黑色素瘤的失巢凋亡抵抗和转移。

图2 对照组和耐药性A375及M14细胞的全转录组RNA-seq结果

2.3 Rt-qPCR及WB分析

为进一步验证转录物组学鉴定到的可能与黑色素瘤耐药性相关的重要基因及信号通路,本研究采用Rt-qPCR及WB分析验证SENP1、YAP在不同细胞株中的表达情况。Rt-qPCR结果如图3A及3B所示,无论对于A375还是M14黑色素瘤细胞株,耐受株的SENP1、YAP表达水平都出现显著上调。其中,A375耐受株(A375-DR)相比对照组(A375-WT),SENP1相对表达量提升了2.2±0.12倍(P<0.001)而YAP相对表达量提升了0.7±0.1倍(P<0.01);相比对照组(M14-WT),M14耐受株(M14-DR)的SENP1相对表达量提升了1.7±0.14倍(P<0.001)、YAP相对表达量提升了2.5±0.18倍(P<0.01)。WB检测同样证实了相似的结论(图3C)。以上结果表明SENP1、YAP在耐药细胞株中表达量的确提升,且有可能与黑色素瘤的耐药性相关。

图3 Rt-qPCR及WB分析SENP1及YAP在不同细胞株中的表达量

2.4 SENP1参与黑色素瘤耐药性并对YAP存在泛素化调控

为进一步明确SENP1在黑色素瘤耐药性中的作用,本研究构建了表达空质粒的细胞株A375-CT及SENP1敲除细胞株A375-SEKO,通过蛋白质杂交确定A375-SEKO细胞株中SENP1的含量显著下降(图4A)。随后,本研究测定了添加不同浓度DTIC下A375-CT和A375-SEKO的细胞活性。正如预期的那样,尽管A375-CT和A375-SEKO的活力均随着DTIC浓度的增加而下降,但A375-SEKO的活力下降速度明显高于A375-CT(图4B)。本文研究结果表明,SENP1参与了DTIC的耐受性的形成。最后,本文研究探究了SENP1与YAP之间是否存在相互作用。考虑到SENP1是泛素化修饰蛋白质,因此我们探究了SENP1对YAP的泛素化修饰作用。如图4C所示,YAP与泛素B(HA-Ub)孵育显著提高了其泛素化修饰程度。然而,与HA-Ub和SENP1共孵育后,YAP的泛素化修饰程度降低,表明SENP1可能调节YAP的去泛素化修饰作用。

图4 SENP1敲除后细胞株DTIC耐药性变化及其对YAP的去泛素化调控作用

3 讨论

黑色素瘤起源于黑色素细胞的基因突变,可在皮肤、眼睛、内耳和软脑膜中发现[12]。黑色素瘤约占所有皮肤恶性肿瘤的1%,是最具侵袭性和最致命的皮肤癌[13]。对于Ⅰ～Ⅲ B期黑色素瘤患者,手术是主要的治疗方法,此外还包括化疗、放射性治疗、免疫治疗、靶向治疗等[14]。除了由于药物缺乏特异性导致皮肤和消化道毒性产生的不良反应外[15],因病灶对化疗等产生的耐药性同样是黑色素瘤治疗目前面临的困境[16]。因此,研究黑色素瘤耐药性的产生机制对于未来改善其化疗治疗效果具有重要意义。

收集广东省惠州市第一人民医院、惠州市中心人民医院、惠州市第三人民医院于2013年1月1日—2016年12月31日的面神经炎住院患者合计882例作为研究对象。其中，惠州市第一人民医院294例、惠州市中心人民医院306例、惠州市第三人民医院282例，诊断标准依照中国特发性面神经炎诊治指南[1]。

黄连对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑菌效果强于革兰氏阴性菌大肠杆菌，这与以往文献报道一致。当用不同溶剂提取时，黄连对2种试验菌的抑菌活性大小顺序为醇提物＞50%醇提物＞水提物；把黄连分成非生物碱、多糖、总碱时，发现这3种组分均有抑菌活性，其中总碱的抑菌活性最强，多糖的抗菌活性较弱。进一步将总碱分离得到4种主要生物碱，其中小檗碱和黄连碱对2种试验菌的活性较强，并且4种主要生物碱之间可能存在协同抗菌关系。

蛋白质泛素化修饰是维持底物蛋白质稳态的重要方式,对蛋白质-蛋白质之间的相互作用、亚细胞定位、基因转录的活性及靶蛋白质的稳定性等具有重要的调节作用[17-18]。研究[19-20]表明,SENP1与肿瘤乏氧微环境、肿瘤发生与转移及多个信号通路的调控有关。除此之外,已有研究表明SENP1与肿瘤耐药性相关,如:Gao等[21]发现SENP1在肺癌细胞中异常过表达,且其过表达对爱拉斯汀或顺铂处理的肺癌细胞具有保护作用;Chen等[22]研究发现,在构建的耐受伊立替康的人结肠癌细胞株中,SENP1蛋白质大量积累;而SENP1的敲低降低了癌细胞的迁移能力,并再次触发了其对伊立替康的敏感性。在本文研究中,发现SENP1在DTIC耐受的黑色素瘤细胞中表达量显著上升,其很有可能在黑色素瘤的耐药性中发挥了重要作用,本研究通过对其编码基因进行敲除进一步确认了其与耐药性的相关关系。

Hippo信号通路最先在果蝇体内被发现,在哺乳动物中具有高度保守性[9]。Hippo通路缺失或过度激活有可能导致细胞异常生长,进而导致肿瘤的发生。在之前的研究中发现在肝癌、结直肠癌和肺癌等多种癌症中Hippo通路相关基因通常发生异常表达并与肿瘤的发生发展相关。哺乳动物Hippo信号通路的核心成分包括细胞质激酶模块和核转录模块。其中,YAP属于核转录模块,具有促癌功能。在本文研究中,转录物组学鉴定到Hippo通路在黑色素瘤耐受细胞株中出现富集,表明该信号通路发生了显著异常表达。其中,YAP表达的上调得到了Rt-qPCR及WB的验证。通过泛素化修饰实验验证,本文证实了SENP1对YAP存在泛素化修饰作用。综上,本文研究构建了DTIC耐受的黑色素瘤细胞株并通过转录物组学鉴定到了异常表达的SENP1基因及Hippo信号通路,证实了SENP1与黑色素瘤耐药性相关并可调控YAP的泛素化。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明赵蓓:实验、撰写及修改论文;施小琪、唐雪梅:数据处理及分析;程石:总体把关,审定论文。