苹果矮化砧木M9T337组培快繁技术研究

2024-03-14王艳芳樊霞

甘肃农业科技 2024年2期

王艳芳樊霞

摘要：矮化栽培是苹果栽培现代化发展的趋势，应用矮化砧木是实现苹果矮化栽培、标准化管理的主要途径。为完善和优化苹果矮化砧木组培繁殖再生体系，以苹果矮化砧木M9T337为试验材料，分别用75%酒精和1 g/kg升汞进行消毒处理，以筛选外植体最佳消毒方案；以M9T337单芽茎段为材料，研究不同培养基配方组合对组培苗污染率、增殖系数、株高、长势、生根个数和生根率等指标的影响。结果表明，最适合外植体消毒的方法为75%酒精30 s＋1 g/kg升汞9 min，最佳M9T337初代培养基、继代培养基和生根培养基配方分别为MS +6-BA 0.8 mg/L + NAA 0.4 mg/L、MS+ BA 1.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L和1/3MS+ IBA 0.1 mg/L。本试验建立了苹果矮化砧木M9T337高效离体快繁技术体系，筛选出了适宜于M9T337最佳扩繁、生根培养基。

关键词：组织培养；矮化砧木；M9T337；苹果

中图分类号：S661.1 文献标志码：A 文章编号：2097-2172（2024）02-0163-04

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.02.012

Study on Tissue Culture and Rapid Propagation Techniques of

Apple Dwarf Rootstock M9T337

WANG Yanfang 1， FAN Xia 2

（1. Tianshui Vegetable Industry Development Office， Tianshui Gansu 741000， China; 2. Tianshui

Fruit Tree Research Institute， Tianshui Gansu 741000， China）

Abstract： Dwarfing cultivation is the developmental trend of modern apple production. Promotion and application of dwarfing rootstock is the main way to realize apple dwarfing cultivation， standardized management for apple production. To improve and optimize the tissue culture and regeneration system of apple dwarf rootstocks， in this study， apple dwarfing rootstock M9T337 was used to screen the best disinfection plan for explants using 75% ethanol and 1 g/kg mercuric chloride， respectively. M9T337 stem-segment with single bud was used to study the effects of different culture-medium combinations on the pollution rate， multiplication coefficient， plant height， growth， rooting number， and rooting rate of tissue culture seedlings. The results showed that 75% ethanol for 30 s + 1 g/kg mercuric chloride for 9 min had the best disinfection effect. The optimal formulations of primary medium， secondary medium and rooting medium were MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.4 mg/L， MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L and 1/3MS+IBA 0.1 mg/L， respectively. In this experiment， the efficient in vitro rapid propagation technology system of apple dwarf rootstock M9T337 was established， and the best propagation and rooting medium suitable for M9T337 were selected as well.

Key words： Tissue culture; Dwarfing rootstock; M9T337; Apple

喬砧苹果园普遍存在管理效率低、投入高、果实产量低品质差等问题，矮化栽培是提高苹果园管理水平和促进高产优质的重要途径，因地制宜地选择矮砧类型对发展矮密苹果栽培非常重要。苹果矮化砧的特点是树体矮小，宜密植，根系发达，繁殖快，具有高产优质和管理方便等特点，易于机械化作业。M9T337是由荷兰木本植物苗圃检测服务中心选育的无病毒M9选拔系，比M9矮化程度高20%，意大利、法国及荷兰等欧美国家已用M9T337繁育的大苗来建园，并成功获得高纺锤树形。该砧木根系发达、须根多、压条易繁殖，新生苗木生长整齐，具有良好的苗圃性状，丰产，早果，易于推广。

目前M9T337主要采用组培快繁和压条繁殖的无性繁殖方式，但是压条繁殖苗木的机体得不到有效更新，植株生长势弱［1 ］，成苗率低，易受季节和母体数量的限制［2 ］，不能大量生产。与传统的繁殖方法相比，组织培养苗木摆脱了季节的限制，能在人工控制条件下达到周年生产，可在较短时间内获得大量的组培苗［3 ］，大大简化了传统育苗（如扦插、嫁接等）的烦琐步骤，且能在较小的面积内大规模生产［4 - 5 ］，可有效降低生产成本。组织培养的苗木根系发达，栽植成活率高、树体健壮、抗病性强、早果丰产，且能够保持遗传性状的稳定性，组织培养育苗在现代农业生产中得到了广泛应用［6 ］，产生了巨大的经济效益和社会效益。2015年，我们从陕西华圣公司引进M9T337，定植于天水市果树研究所苹果种质资源圃，并于2020年建立M9T337无菌系，同时进行了扩繁继代、生根培养研究，以期为M9T337规模化生产及遗传转化体系构建奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为天水市果樹研究所苹果种质资源M9T337（2015年从陕西华圣公司引进定植），树龄6 a，树体生长健壮，新梢发育良好。2020年4月下旬晴天上午取生长健壮、发育良好的幼嫩新梢，切取顶端3～4节作为外植体及时送实验室处理。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒与初代培养将外植体置于 1 000倍洗洁精液中浸泡30 min，然后用流水冲洗10 min。用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗5次，升汞溶液1 g/kg分别浸泡8、9、10 min，再用无菌水冲洗5次。将经消毒处理的外植体置于无菌滤纸上，吸取多余的水分，切去受伤截面，取1.5～2.0 cm单芽茎段作为外植体接入启动分化培养基（灭菌后在培养室静置3 d以上）［7 ］。试验共设3个处理，分别为Ⅰ：MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.4 mg/L；Ⅱ：MS+6-BA 0.8 mg/L+ NAA 0.4 mg/L；Ⅲ：MS+ 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L。每瓶（培养基）2个芽，接种10瓶，3次重复，转入温度为18～22 ℃、湿度为55%～75%、光照强度为500～1 500 Lx的培养室中培养。每3 d观察1次，对褐化的外植体及时更换培养基。40 d后调查外植体生长情况。

污染率=（污染数/接种数）×100%

褐化率=（褐化数/接种数）×100%

成活率=（成活数/接种数）×100%

1.2.2 继代扩繁培养基筛选以初代培养所获长势健壮的组培苗为材料，选取2～4 cm长的茎段，切取约1.3～1.7 cm的带芽茎段进行继代培养扩繁［8 - 9 ］，继代培养基6-BA、NAA浓度组合见表1［10 - 11 ］。

基于筛选出的最佳扩繁继代培养基，设置4个不同浓度CH（水解酪蛋白）处理，即 0.2、0.3、0.4、0.5 g/L，每组处理接种10瓶，每瓶接种4个外植体，重复3次。40 d后调查外植体的扩繁数和幼苗高度及长势。

1.2.3 生根培养基筛选选取长势健壮、叶色浓绿的组培苗，截取长约2.0 cm的带芽茎段接入含有不同浓度IBA（0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/L）的1/3MS基本培养基中进行生根培养［12 ］。培养室温度22～26 ℃、湿度55%～75%、光照强度1 800～2 400 Lx。每组处理接种10瓶，每瓶接种4个外植体，重复3次，40 d后调查外植体的生根数和增殖倍数。

生根率=（生根的芽苗数/接种的芽苗总数）×100%

生根单株数=生根总条数/生根株数

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对M9T337外植体消毒效果的影响

M9T337外植体经过消毒灭菌后接种到初代培养基5 d后出现不同程度的污染。如表2所示，75%酒精浸泡30 s后，用1 g/kg升汞活液消毒9 min和10 min处理用的外植体污染率均显著低于消毒8 min处理，成活率显著高于消毒8 min处理。褐化率随着消毒时间的延长逐渐上升。从污染率、褐化率、成活率等3个指标看，75%酒精浸泡30 s+1 g/kg升汞消毒9 min效果最佳，且最佳初代培养基为MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.4 mg/L。

2.2 不同浓度激素配比对M9T337生长增殖的影响

选取初代培养里长势健壮的植株进行继代培养，将其接种于不同激素组合的培养基中［13 ］，结果发现获得的新生茎尖数均显著高于不加激素的对照处理（表3）。其中，在6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L处理中，M9T337新生株的株高最高，为1.87 cm，增殖系数为5.18，且增殖芽生长良好，说明适宜于M9T337的最佳继代培养基为MS+ 6-BA 1.0 mg+NAA 0.5 mg/L。

2.3 不同浓度CH对M9T337生长增殖的影响

在1 L MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L培养基中分别加入不同浓度的CH［14 ］，结果发现0.4 g/L CH处理的增殖系数显著高于0.2、0.3 g/L CH处理，其芽长势好、叶色浓绿、健壮（表4）。但CH浓度增大至0.5 g/L时，培养基出现不凝固现象，试管苗的株高显著低于0.4 g/L CH处理，并且出现生长迟缓、长势下降、污染加重的现象。

2.4 不同浓度IBA对M9T337生根的影响

在1/3MS培养基中分别加入不同浓度IBA，生根培养结果如表5所示。当IBA浓度为0.10 mg/L时，瓶苗生根率为89.5%，显著高于其他处理，且根洁白、粗壮、整齐；当IBA浓度为0.04 mg/L时，生根率为59.6%，显著低于其他处理，侧根细且较少，根较短。IBA浓度为0.08、0.10 mg/L处理平均生根数分别为5.52、5.86条/株，显著高于其他处理，但0.8 mg/L处理的根茎部诱发出愈伤组织，且根的发育呈现畸形，不利于根及茎尖正常生长，不利于移栽成活。可见，IBA浓度0.10 mg/L 的1/3MS培养基有利于M9T337的生根和生长。

3 讨论与结论

植物离体培养的关键在于外植体的建立，而外植体的采集时间和消毒时长等因素影响无菌系的建立。在试管苗的组培快繁中，升汞常用于外植体的消毒，杀菌时间太短达不到消毒效果，时间太长会引起植物中毒死亡或者褐化严重。本研究发现，对于苹果砧木M9T337而言，外植体的消毒方式以75%酒精浸泡30 s加1 g/kg升汞消毒9 min效果最好，最佳初代培养基为MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.4 mg/L。试验过程中发现，在外植體采集时，天气情况可影响初代培养的成活率，晴天采集成活率较高，其原因有待进一步研究。基本培养基组成成分和植物生长调节物质对植物试管苗增殖快繁具有重要影响。本研究中，不同配比细胞分裂素6-BA和NAA对M9T337试管苗增殖有显著影响。在继代扩繁培养中，当6-BA与NAA浓度在一定范围内，茎段的增殖系数随着2种激素浓度的增加而增加。其中，6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L处理的株高较高，且叶片较大，枝条更为粗壮，新生茎尖数最多。但是当激素浓度超过一定范围时，组培苗生长被抑制，生长量和有效茎尖数下降，玻璃苗增多，试管苗生长出现异常［15 ］。

本研究发现，CH对M9T337试管苗增殖有重要影响。当培养基中加入0.4 g/L的CH时，能有效促进M9T337芽的分化增殖生长，且芽叶色浓绿、生长健壮，增殖系数高［16 - 17 ］。随着CH浓度进一步增加，虽然芽的增殖系数提高，但试管苗污率染也显著增加，提示高浓度CH在促进试管苗增殖的同时可能也会利于细菌的繁殖。为了得到较高的增殖倍数，同时将细菌污染率控制在阈值之内，适宜的CH浓度或其他药剂代替CH还需进一步研究。生根培养是离体快繁的关键，直接影响工厂化繁育的成败。王淑华等［18 ］研究表明，‘嘎啦苹果试管苗生根培养时IAA表现优于IBA和NAA；而吴玉霞等［19 ］在‘粉红佳人试管苗生根培养时发现，IBA比IAA明显提高生根率。本研究发现，在1/3MS基本培养基中加入0.1 mg/LIBA时，试管苗生根效果最好，与前人的研究基本一致。

参考文献：

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