CCR8在卵巢癌浸润性Treg上的表达与意义

陶子琦，茅晔鹏，刘书娜，娄鉴芳，付 鑫，张 磊，严丽娜，3，王 婷，王 芳*

1南京医科大学第一附属医院检验学部，2国家医学检验临床医学研究中心分中心，江苏 南京 210029；3南京市妇幼保健院妇科，江苏 南京 210004

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，由于其发病隐匿，进展迅速，且缺乏有效的早期筛查手段，多数患者确诊时已为晚期。虽然免疫治疗是卵巢癌治疗的一个有前途的新领域，多种有希望的免疫治疗手段已被研发，但仍然需要克服免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）以提高免疫治疗的疗效［1-3］。TME 中的免疫抑制是促进肿瘤生长与转移最为重要的前提条件之一，是肿瘤免疫治疗的主要障碍之一［4］。免疫抑制性细胞及抑制因子是肿瘤免疫抑制微环境的重要组成部分，调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）是其中的重要一员，通过不依赖于细胞接触（分泌抑制性细胞因子）或依赖于细胞接触（调节抗原呈递细胞功能和介导靶细胞的溶解或凋亡）的机制发挥免疫抑制功能，阻碍肿瘤特异性免疫反应［5-7］。趋化因子-趋化因子受体（C-C motif chemokine receptor，CCR）信号介导的募集作用是肿瘤内Treg浸润的主要机制。研究显示有多个CCR 通过与趋化因子配体（chemokine ligand，CCL）的结合，如CCR4-CCL17/22、CCR5-CCL5、CCR8-CCL1/18 和CCR10-CCL28 等，参与招募Treg到TME［8-11］。与正常组织驻留及外周Treg 相比，人肺癌、乳腺癌及大肠癌等肿瘤浸润性Treg上选择性高表达CCR8［12］。而CCR8 在卵巢癌肿瘤浸润性Treg 上是否高表达，CCR8+Treg 是否是卵巢癌肿瘤浸润Treg 的主要类型，相关问题尚未明确。因此，本研究以小鼠卵巢上皮癌细胞ID8构建的卵巢癌荷瘤C57BL/6小鼠模型为对象，分析CCR8在卵巢癌肿瘤浸润性Treg中的表达，及其对Treg分化的作用。

1 对象和方法

1.1 材料

C57BL/6小鼠卵巢上皮癌细胞ID8（深圳豪泰生物公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；青霉素-链霉素溶液、红细胞裂解液和DMSO溶液（上海碧云天生物公司）；高浓度基质胶（南京优宁维生物公司）；RPMI 1640 培养基（Hyclone 公司，美国），X-Vivo 15培养基（Lonza 公司，瑞士）；小鼠初始CD4+T Cell 提取磁珠（Miltenyi 公司，德国）；AZ084（Med Chem Express 公司，美国）；CD3e 单抗、CD28 单抗（eBioscience 公司，美国）；重组鼠IL-2（Peprotech 公司，美国）；TGF-β（R&D 公司，美国）；PE/Cyanine7 标记的抗小鼠CD45、Brilliant Violet 510 标记的抗小鼠CD3、FITC 标记的抗小鼠CD4、PE 标记的抗小鼠Foxp3、Brilliant Violet 421 标记的抗小鼠CCR8、APC标记的抗小鼠细胞毒性T 淋巴细胞抗原4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4）、APC 标记的抗小鼠程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD1）、APC标记的抗小鼠淋巴细胞激活基因3（lymphocyte-activation gene 3，LAG-3）、APC标记的抗小鼠可诱导的T 细胞共刺激分子（inducible T cell costimulator，ICOS）等流式抗体（Biolegend 公司，美国）；Ⅳ型胶原酶（Gibco 公司，美国）；Percoll 细胞分离液、透明质酸酶、DNA酶Ⅰ、谷氨酰胺（Sigma公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 TCGA数据库、GTEx数据库分析

下载426 例TCGA 数据库中上皮性卵巢癌组织（https：//portal.gdc.cancer.gov）与88 例GTEx 数据库中卵巢正常组织（http：//gepia.cancer-pku.cn/）的RNA-seq 数据，以|Log2TPM|>1 和P＜0.05 为显著差异标准对趋化因子CCL1、CCL18 作差异分析，并基于R 包-GSVA［1.46.0］中提供的ssGSEA 算法，计算各类免疫细胞：Treg、中性粒细胞、B 细胞、肥大细胞、Th17 细胞、Tgd细胞的浸润比例，使用Spearman统计方法分析基因CCR8［ENSG00000179934.7］与各免疫细胞的相关性，使用R包-ggplot2［3.3.6］对分析结果进行可视化。

1.2.2 小鼠皮下成瘤实验

本动物实验获得南京医科大学实验动物福利伦理委员会批准（IACUC-2303001）。20 只C57BL/6小鼠购自南京集萃药康生物科技公司。5×106个ID8细胞在复苏后经过3次传代培养，制备成100 μL细胞悬液，同时添加100 μL 20 mg/mL胶原蛋白的高浓度基质胶悬液，混匀后接种在小鼠腋下至侧腹的皮下部位，接种之后，小鼠仍置于SPF环境继续生长21 d后CO2窒息处死，取脾脏、肿瘤组织、外周血样本。

1.2.3 小鼠样本处理

将脾脏组织碾磨后制备成单细胞悬液，使用红细胞裂解液分别分离出脾脏和外周血样本中的单个核细胞。将新鲜的小鼠皮下卵巢肿瘤组织剪成1 mm3的小块，在配制的原代组织消化液［RPMI-1640 培养基+胶原酶Ⅳ（1 μg/mL）+透明质酸酶（100 ng/mL）+DNA 酶Ⅰ（50 U/mL）+谷氨酰胺（1 mmol/L）+1%青霉素-链霉素溶液］中37 ℃消化1 h 后40 μm 滤器过滤，将过滤后细胞悬液使用70%Percoll、30%Percoll梯度离心，得到单个核细胞悬液。

1.2.4 流式检测小鼠样本中Treg细胞上CCR8以及免疫检查点相关蛋白的比例

将小鼠脾脏、外周血、肿瘤组织的单个核细胞悬液铺在流式管底，加入PE/Cyanine7标记的抗小鼠CD45、Brilliant Violet 510 标记的抗小鼠CD3、FITC标记的抗小鼠CD4、PE 标记的抗小鼠Foxp3、Brilliant Violet 421 标记的抗小鼠CCR8、APC 标记的抗小鼠CTLA-4、APC标记的抗小鼠PDI、APC标记的抗小鼠LAG-3、APC 标记的抗小鼠ICOS 等流式抗体，经孵育、破核、洗涤、固定后使用Beckman Cytoflex流式仪进行检测。

1.2.5 体外诱导小鼠Treg细胞实验

雌性C57BL/6 小鼠，6～8 周龄，体重18～20 g。2%戊巴比妥麻醉小鼠，无菌操作下取脾脏，碾磨匀浆分离脾脏细胞，裂解红细胞后得到单个核细胞，以磁珠提取初始CD4+T 细胞。圆底96 孔板以4 μg/mL CD3 单抗4 ℃包被过夜后，加入15 ng/mL hTGF-β、30 U/mL鼠IL-2、2 μg/mL CD28单抗，将初始CD4+T细胞以X-Vivo 15培养基调至1×106个/mL铺在圆底96孔板中，隔天半定量换液并传代。AZ084是一种强效的CCR8 变构拮抗剂，其Ki 值为0.9 nmol/L，以DMSO作为溶剂溶解10 mg AZ084粉末，将其制备为AZ084储存液（5 mmol/L）。依据不同处理方式分为AZ084组、DMSO组与MOCK组。AZ084组在诱导过程中每日加入5 μmol/L 的CCR8 变构拮抗剂AZ084，DMSO组在诱导过程中每日加入与AZ084组同体积的DMSO溶液，MOCK组为空白对照，只诱导分化不做其他任何处理。诱导培养3～5 d，流式检测CD4+Foxp3+Treg细胞的比例。

1.3 统计学方法

所有数据使用SPSS 25.0 统计软件进行数据分析，各组数据均以均值±标准差（±s）表示，两组间的比较，符合正态分布的数据用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析，非正态性分布数据采用Mann-Whitney 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 趋化因子CCL18 在卵巢癌与癌旁组织中的表达存在显著差异

利用TCGA 与GTEx 公共数据库获取上皮性卵巢癌组织以及卵巢正常组织的RNA-seq 数据，分析CCL1 mRNA 与CCL18 mRNA 在卵巢癌中的表达情况，发现CCL1基因在人类卵巢癌组织（n=426）与卵巢正常组织（n=88）中无明显差异（图1A），CCL18基因在人类卵巢癌组织中显著上调（非配对样本，P<0.05，图1B）。同时对CCL1、CCL18 的受体CCR8 作免疫浸润分析与Spearman相关性分析，绘制棒棒糖图（图2），结果显示CCR8基因与卵巢癌浸润的Treg细胞具有高相关性（R=0.592，P＜0.05）。

图1 趋化因子CCL1 和CCL18 mRNA 在TCGA 上皮性卵巢癌组织数据集和GTEx卵巢正常组织数据集中的表达水平Figure 1 Chemokine mRNA expressions of CCL1 and CCL18 in epithelial ovarian cancer tissues of TCGA and normal ovarian tissues of GTEx

图2 人卵巢癌免疫细胞与CCR8基因的Spearman 相关性分析Figure 2 Spearman correlation analysis between the CCR8 gene expression and immune cell infiltration in human ovarian cancer

2.2 CCR8 及免疫检查点相关蛋白PD-1、CTLA-4、LAG-3、ICOS在卵巢癌小鼠模型的肿瘤组织、外周血及脾脏中Treg上的表达情况

采用CO2窒息法处死8 例C57BL/6 卵巢癌荷瘤小鼠，对其皮下瘤模型进行瘤体大小测量，根据公式V=1/2×a×b2（a为长轴，b为短轴）计算得出肿瘤体积为800～1 200 mm3（图3）。采用流式细胞术（图4）检测8 例荷瘤小鼠的肿瘤组织（图5）、外周血（图6）、脾脏（图7）的单个核细胞悬液中Treg 细胞上的CCR8表达，结果显示小鼠肿瘤浸润性的CCR8+Treg占总Treg的比例为（74.3±13.2）%，而在小鼠脾脏、外周血中分别为（44.0±8.5）%、（16.9±7.8）%，小鼠肿瘤中浸润性CCR8+Treg 占总Treg 的比例显著高于小鼠脾脏、外周血。小鼠外周血、脾脏、肿瘤中浸润性CCR8+Treg 中PD-1+细胞亚群的比例分别为（16.4±8.8）%、（50.0±16.4）%、（80.0±12.4）%，LAG-3+细胞亚群的比例分别为（11.3±6.9）%、（19.6±11.7）%、（74.0±8.7）%，ICOS+细胞亚群的比例分别为（18.3±10.5）%、（20.9±7.5）%、（72.3±6.8）%，CTLA-4+细胞亚群的比例分别为（13.5±6.7）%、（26.1±16.9）%、（49.1±15.7）%。小鼠肿瘤浸润性CCR8+Treg中PD-1+、LAG-3+、ICOS+、CTLA-4+细胞亚群的比例显著高于脾脏和外周血（Mann-Whitney检验，P＜0.05，图8）。

图3 C57BL/6小鼠卵巢癌皮下瘤代表图Figure 3 Representative images of subcutaneous tumors in C57BL/6 mice of ovarian cancer

图4 小鼠模型来源样本流式细胞术检测方案Figure 4 A flow cytometry strategy for samples from the mouse model

图5 小鼠卵巢癌肿瘤浸润性CCR8+Treg细胞比例与表型流式检测图Figure 5 Proportion and phenotype of tumor infiltrating CCR8+Treg cells in mouse ovarian cancer tissues detected by flow cytometry analysis

图6 小鼠外周血中CCR8+Treg细胞比例与表型流式检测图Figure 6 Proportion and phenotype of CCR8+Treg cells in mouse peripheral blood detected by flow cytometry analysis

图7 小鼠脾脏中CCR8+Treg细胞比例与表型流式检测图Figure 7 Proportion and phenotype of CCR8+Treg cells in mouse spleens detected by flow cytometry analysis

图8 小鼠肿瘤组织、脾脏、外周血中Treg细胞表型分析Figure 8 The phenotype analysis of Treg cells in mouse tumor tissues，spleens and peripheral blood

2.3 体外实验中CCR8 拮抗剂抑制小鼠的初始CD4+ T细胞向Treg细胞的诱导分化

小鼠脾脏的初始CD4+T 细胞向Treg 细胞诱导分化，结果显示AZ084 组、DMSO 组、MOCK 组的Treg 细胞分化比例分别为（29.1±8.8）%、（52.2±9.6）%、（70.6±16.7）%，AZ084 组与DMSO 组、MOCK组差异均有统计学意义（P＜0.05，图9）。

图9 比较AZ084、DMSO、MOCK组初始CD4+T细胞向Treg细胞分化的比例Figure 9 Comparisons in the proportion of naive CD4+T cells differentiating into Treg cells in AZ084，DMSO and MOCK groups

3 讨论

卵巢癌是病死率最高的妇科恶性肿瘤，虽然治疗方法不断改进，但是卵巢癌患者的生存率并没有明显提高。近年来免疫治疗逐渐显示出巨大潜力。TME 的复杂性和多样性对免疫治疗的效果具有重要影响。深入阐明卵巢癌免疫抑制微环境的产生机制，探索提高免疫治疗效果的新策略是卵巢癌治疗的研究方向。卵巢癌免疫抑制微环境形成的主要机制之一是Treg 细胞抑制CD8+效应性T 细胞杀伤肿瘤的功能。肿瘤浸润性Treg高度活化、增殖，具有很大的异质性［13］，而趋化因子和细胞因子依赖的募集是Treg 细胞向肿瘤浸润的主要机制。如趋化因子CCL1和CCL18，由肿瘤细胞和TME内的树突状细胞分泌，与Treg细胞上的CCR8受体结合，引导它们向肿瘤部位移动［14-15］。细胞因子IL-2，通过与Treg 细胞表面上的CD25（IL-2 受体的α链）结合，能够促进Treg 细胞的活性和增殖。在一些肠癌模型中，通过增加IL-2的浓度可以显著增加Treg细胞在TME中的数量［16］。因此，在抗肿瘤免疫治疗中，Treg细胞的调节和耗竭策略被认为是有效的方法。然而，由于缺乏对肿瘤浸润性Treg群体的良好选择性，这些策略往往导致严重的不良反应［17］。因此需要开发一种针对肿瘤浸润性Treg 细胞的特异性靶向标志物。

本研究发现在小鼠模型中，CCR8 作为卵巢癌最稳定和差异表达的趋化因子受体，CCR8+Treg是卵巢癌浸润性Treg 的主要类型，CCR8+Treg 中PD-1+、CTLA-4+、ICOS+、LAG-3+亚群也显著高于脾脏和外周血液，提示CCR8+Treg 可能是卵巢癌主要的浸润性Treg，在肿瘤免疫抑制微环境中发挥主导作用，其抑制性与共刺激性的亚群都比外周组织中更活跃，因此可能在卵巢癌免疫逃逸中发挥作用。同时，CCR8变构拮抗剂AZ084 明显抑制初始CD4+T 细胞向Treg 细胞的诱导分化。最新研究也显示，在人类乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌以及小鼠黑色素瘤、非小细胞肺癌等模型中，肿瘤浸润性Treg 细胞上的CCR8 表达增高［18］，与本研究的结论基本一致。因此靶向卵巢癌浸润性CCR8+Treg，选择性地清除CCR8+Treg 或抑制其功能，可控制或改善TME 的免疫抑制状态，有利于提高卵巢癌免疫治疗的疗效。但目前研究暂不足以说明CCR8对肿瘤浸润性Treg发挥功能具有必要性，后续将进一步研究直接敲除Treg上的CCR8基因对肿瘤浸润性Treg 免疫表型与功能的影响以及CCR8+Treg 功能调控的分子机制，从而为卵巢癌的靶向免疫治疗提供更精准的分子诊断依据。