八角柱头可授性、花粉活力和座果率分析

黄开顺，李开祥，梁文汇，曾祥艳，杨卓颖

（广西壮族自治区林业科学研究院 广西特色经济林培育与利用重点实验室 国家林业和草原局八角肉桂工程技术研究中心 广西木本香料工程技术研究中心，广西南宁 530002）

八角（Illiciumverum）是适生于我国南亚热带丘陵山地的经济树种，主要产品为八角果及从果和枝叶提取的茴香油，被广泛用作食品香料及日化香精和医药原料[1]。广西是世界上最大的八角产地，八角种植面积达36.56 万公顷，在毗邻广西的云南省文山壮族苗族自治州也有大量栽培，其中富宁县八角种植面积达4.4万公顷[2]。

八角开花主要集中在8—10 月，这段时间也是上1 年开花座果的成熟期，八角具有花果同期的生物学特性[3]。在长达3 个月的花期跨度中，8、9 月属高温、高湿的夏季；10 月，天气转凉，空气明显干燥，气候条件发生变化；不同月份间花粉活力和座果率是否有差异，目前未有研究对其进行探讨。八角花器官的发育过程从形态上可分为花蕾期、初开期、盛开期和凋谢期4 个发育阶段，花蕾期可进一步细分为小蕾期和含苞欲放大蕾期，整个过程历时约31.20 天，其中花蕾期约27.69 天，初开期、盛开期和凋谢期共约3.51 天[3]。在不同发育阶段，八角花器官柱头的可授性是否有差异，也尚未明确。本研究针对以上两个问题，分析八角花器官在不同发育阶段柱头可授性的差异及不同月份开花花粉活力和座果率的差异，探讨八角柱头的最佳可授时期，为八角杂交育种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在广西壮族自治区林业科学研究院八角种质资源收集圃（108°21′E，22°55′N）内选择15 年生、同一品系、树冠自然开张且无病虫害的3 株八角为试验材料，于2017 年8—10 月开展柱头可授性、花粉活力和座果率调查。

1.2 试验方法

1.2.1 柱头可授性检测

9 月中旬，每株采集含苞欲放、初开、盛开和凋谢的花器官各3朵。野外现场观察并记录开放花器官的花药是否开裂，将所有花器官立即带回实验室检测柱头可授性。采用联苯胺-过氧化氢法检测柱头可授性[4]。将柱头浸入联苯胺-过氧化氢溶液，30 min 后采用放大镜观察柱头染色部位；柱头呈蓝色并伴有气泡出现，表明柱头具有可授性，否则柱头无可授性。

1.2.2 花粉活力测定

8—10 月每月中旬，每株采集6 朵花药刚开裂、散粉不久的花器官，立即带回实验室进行花粉活力测定。采用TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）染色法分析花粉活力[5]。每朵花制作1 个花粉染色玻片。在载玻片上滴2 滴TTC 液，将八角花雄蕊在载玻片上的TTC 液中反复蘸动，使花粉散落至TTC 液中并摊匀，盖上盖玻片。将玻片置于室外日光下直晒5～20 min，肉眼看见玻片内呈现淡红色时立即搬回室内，在显微镜下观察花粉染色情况并记录。采用生物显微镜Nikon ECLIPSE 80i 及其图像分析软件NIS-Elements D，放大观察花粉染色效果。每个玻片在10×0.25 倍镜下观察5 个视野，采用40×0.75 倍镜放大辅助观察。根据花粉染色程度判定其活力强弱，红色代表活力强，淡红色代表活力弱，未染红色代表无活力。花粉活力百分率计算公式为：

1.2.3 座果率调查

8—10 月每月中旬，每株选择含苞欲放花蕾60个。其中，套袋处理30 个；以单个花蕾进行套袋隔离处理，用白色硫酸纸袋套住花蕾和小枝，密封袋口。不套袋处理30 个，为对照。30 天后，每株分别调查和统计套袋处理和不套袋处理的座果率，计算公式为：

1.3 数据处理

花粉活力百分率和座果率均取单株平均值，采用Excel 2010 软件进行数据处理；采用SPSS 22.0 软件进行方差分析，采用LSD法进行多重比较[6]。

2 结果与分析

2.1 八角花器官不同发育阶段柱头可授性

八角花的柱头数量多为8 个，雄蕊10～26 枚；雄蕊围绕柱头排列，上端有2个花药室，花药室开裂后散出花粉（图1 a～c）。将柱头浸泡至联苯胺-过氧化氢溶液中，柱头表面呈蓝色并伴有气泡出现（图1d），说明柱头已具有可授性，可接受花粉并实现传粉和受精。

图1 八角花器官及其柱头可授性检测Fig.1 Floral organ and determination of stigma receptivity of I.verum

八角花器官在含苞欲放大蕾期和初开期，所有柱头已具有可授性（表1）。发育至盛开期，多数柱头仍具有可授性，但部分柱头可授性开始下降，甚至已失去可授性。发育至凋谢期，绝大多数柱头已没有可授性，接受花粉能力衰退甚至丧失。花药发育进程与柱头可授性变化趋势相反；含苞欲放大蕾期和初开期，花药基本未开裂；盛开期至凋谢期，花药开裂并大量散出花粉。

表1 八角柱头可授性及花药发育Tab.1 Stigma receptivity and anther development of I.verum

2.2 八角不同月份开花花粉活力

通过TTC 液处理后，八角花粉显色反应灵敏，在显微镜下观察，可发现强活力花粉呈红色，弱活力花粉呈淡红色，发育不良、无活力花粉基本无明显着色（图2）。

图2 TTC染色法检测八角花粉活力Fig.2 Pollen vitality of I.verum detected by TTC staining method

8—10 月，有活力花粉百分率分别为90.27%、96.62%和69.81%；8、9 月有活力花粉百分率均较高，10 月有活力花粉百分率显著下降（P<0.05）（图3）。8—10 月，强活力花粉百分率逐渐下降，分别为66.73%、63.52%和35.63%；弱活力花粉百分率逐渐上升，分别为23.53%、33.10%和34.18%。八角8、9月开花，有活力和强活力花粉百分率均较高，较有利于传粉。

图3 八角不同月份开花花粉活力百分率Fig.3 Percentages of pollen vitality of I.verum flowering in different months

2.3 八角不同月份开花座果率

八角不同月份开花，座果率差异显著（P<0.05）（图4）。8 月套袋座果率为10.00%，不套袋自然座果率为62.41%；9 月套袋座果率为22.22%，不套袋自然座果率为76.88%；10 月套袋座果率为4.44%，不套袋自然座果率为61.48%。不论套袋与否，9 月开花的座果率均显著高于8 和10 月；各月份的套袋座果率均明显低于未套袋座果率。

图4 八角不同月份开花的座果率Fig.4 Fruit setting rates of I.verum flowering in different months

3 讨论与结论

许多研究表明，植物柱头的可授性在花器官发育和开放过程中会发生变化。余道平等[7]研究发现，峨眉拟单性木兰（Parakmeriaomeiensis）在花被片初展期间，柱头可授性最强，此时柱头有大量粘性分泌物便于接受花粉，但盛开时仅部分柱头具有可授性。本研究结果显示，八角花器官在含苞欲放大蕾期，所有柱头已具备可授性；至盛开期，部分柱头已丧失可授性；至凋谢期，绝大多数柱头已没有可授性。在杂交授粉工作中，应选择八角花器官处在含苞欲放大蕾期至花瓣初开期柱头具有可授性时进行人工授粉，能获得更高的成功率。观察中发现，八角雄蕊花药发育进程与柱头可授性变化趋势相反，在盛开期至凋谢期才大量开裂散粉；说明八角柱头可授期与雄蕊花药散粉期不同步，具有雌蕊先熟的生殖特性。这可能是八角为了提高生存能力，避免近交衰退，发展了一种雌雄蕊异熟的时间隔离繁殖策略，降低花粉落在自身柱头上的概率，减少自交，促进异交，增加遗传多样性。与八角亲缘关系较近的古老孑遗植物群体木兰科（Magnoliaceae）树种也通过雌雄蕊异熟机制提升物种的繁殖能力；香港木兰（Magnoliachampionii）雌蕊可授期和雄蕊可授期完全没有重叠[8]；玉兰（Magnoliadenudata）雌蕊可授期和雄蕊可授期间隔36 h[9]；广玉兰（Magnoliagrandiflora）仅存在1 个短暂的雌雄重叠期[10]；灰木莲（Manglietiaglauca）雌蕊比雄蕊早2～3天成熟[11]。

花粉活力受自身遗传特性和外界因素的影响，温度和湿度是影响花粉寿命的重要因素[12]。花粉有活力是杂交育种成功的前提条件，花粉采集时间是影响花粉活力的重要因素[13-14]。了解花粉的可育性变化规律，并选择在花粉普遍具有活力的时期进行授粉，可提高授粉成功率。本研究结果显示，8—10月，八角有活力花粉百分率差异显著；8、9 月的有活力和强活力花粉百分率均较高，10 月较低。可能与10 中旬入秋后气温下降有关，气候条件发生明显变化，大部分花粉活力下降甚至丧失，说明八角繁殖喜欢暖热气候条件。Hedhly 等[15]认为，植物花粉萌发的最佳温度反映该植物自然花期的温度适应性。陈新伟[16]研究发现，部分番茄（Solanumlycopersicum）品种花粉对气温的敏感性较强，气温下降会导致花粉活力百分率下降。陈燕等[17]研究发现贯月忍冬（Lonicerasempervirens）和金银花（Lonicerajaponica）的花粉在高温环境中更容易萌发。

八角不同月份开花的座果率差异显著，9 月开花的自然座果率显著较高，8 和10 月开花的自然座果率均较低；对花蕾进行套袋隔离处理后，也是9月开花的座果率显著较高；各月份套袋座果率均明显低于未套袋座果率。套袋阻隔了风、昆虫等传粉媒介的作用，无法发生异花传粉，但存在自花授粉现象，座果率较低，也说明八角座果主要来自于异花传粉，雌雄蕊异熟特性也印证了这一结论。许多木兰科植物的自交座果率低甚至不座果；景宁木兰（Magnoliasinostellata）自交座果率仅2%[18]；小花木兰（Magnoliasieboldii）套袋后不座果[19-20]。

9 月是八角有活力花粉百分率最高的时期，此时开花的座果率也最高，最适合采集花粉进行杂交授粉。八角柱头的最佳可授期为花蕾含苞欲放大蕾期，授粉时宜选择准备开放的花蕾作为母本。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突。

作者贡献声明：黄开顺负责试验实施和论文撰写；李开祥负责试验构思指导；梁文汇负责试验设计；曾祥艳负责数据分析和图表绘制；杨卓颖负责野外调查和试验实施。