LC-3、Beclin-1和P62表达与非小细胞肺癌临床病理特征的相关性

万 琼 薛春丽 李秀明 侯智亮

受吸烟、环境污染、遗传等因素的影响,肺癌一直居于我国癌症死亡原因的首位,也是全球癌症相关死亡的最主要原因[1]。非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常见的类型,患者早期多起病隐匿,除偶有咳嗽、气促外,多无典型临床症状,待发现时多已错过最佳治愈时机。近年来,有关肺癌发病机制的研究愈来愈多,虽尚未明确具体作用机制,但已有证据证实患者机体自噬系统异常与NSCLC的发病和转移均有密切联系,而在治疗早期通过对微管相关蛋白1轻链3(LC-3)、自噬调控因子Beclin-1和P62等自噬系统相关蛋白表达情况的测定,也能进一步提升对肺癌发生发展情况评估的准确性,以为后续的治疗方案选择提供更多理论参考[2-3]。基于此,本院对93例NSCLC患者资料进行回顾性分析,探究LC-3、Beclin-1和P62表达情况与NSCLC临床病理特征的相关性,为NSCLC的早期诊断评估提供更多辅助参考。

1 材料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2020年1月至2022年12月本院收治的93例NSCLC患者资料。纳入标准:①病理学确诊为NSCLC[4];②临床及随访资料完整。排除标准:①小细胞肺癌;②合并其他部位肿瘤等恶性疾病;③切除肺癌组织时接受过放化疗或其他抗癌治疗;④病理组织污染。所有研究样本中男性57例,女性36例;年龄34～74岁,平均年龄(59.44±6.33)岁;肺鳞癌51例,肺腺癌42例;TNM分期Ⅰ期29例,Ⅱ期27例,Ⅲ期25例,Ⅳ期12例;高分化19例,中分化48例,低分化26例;淋巴结转移25例。本研究为回顾性分析,已免去患者知情同意及医学伦理审批。

1.2 方法

1.2.1 组织切片制作、染色及免疫组织化学检测 切片制作、染色:取患者癌组织及癌旁组织(距离癌组织2～3 cm)标本进行研究。将所有样本进行常规切片、烤片、脱蜡及水化处理后,采用苏木精进行染色5 min,后以蒸馏水冲洗30 s,1%盐酸乙醇进行分化2 s,再以蒸馏水冲洗30 s。用促蓝液进行反蓝20 s后用蒸馏水冲洗10 min,再以伊红溶液浸泡2 min,再次脱水水化后通过中性树脂进行封片。免疫组织化学检测:将组织切片脱蜡水化后,配置抗原修复液以高温水煮法进行抗原修复,置于沸水中30 min后冷却至室温,再以蒸馏水洗涤3次,单次洗涤时间为5 min。将切片置于3%的过氧化钠溶液中30 min,再用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤3次,单次洗涤时间为5 min。先用LC-3、Beclin-1和P62进行一抗孵化,4 ℃孵化过夜。再于次日以生物素化二抗工作液进行二次孵化30 min,而后加入辣根酶标记链霉卵白素30 min,用含0.03%过氧化氢溶液0.05%二氨基联苯胺进行显色,通过显微镜观察染色深度,至适合深度后用蒸馏水终止染色,再用苏木精进行复染30 s后,以蒸馏水冲洗,而后进行清洗封片,完成免疫组织化学染色。

1.2.2 LC-3、Beclin-1和P62表达情况评估 由2位资深病理医师共同对所有病例切片进行双盲阅片对LC-3、Beclin-1和P62表达情况进行评估。每张切片选择10个高倍视野(×400),统计视野中100个细胞中阳性细胞比例及染色强度。细胞阳性染色为细胞质呈褐色或棕黄色颗粒样,阳性细胞比例评分标准:阳性细胞占比<5%记为0分,阳性细胞占比在5%～25%记为1分,阳性细胞占比在25%～50%记为2分,阳性细胞占比>50%记为3分。染色强度评分标准:细胞无染色记为0分,细胞染色呈淡黄色颗粒记为1分,细胞染色呈棕黄色颗粒记为2分,细胞染色呈棕褐色颗粒记为3分。总评分为两项评分相乘,总评分≤3分提示相应蛋白阴性表达,总评分>3分提示相应蛋白阳性表达。

1.3 观察指标

比较NSCLC患者癌组织和癌旁组织中LC-3、Beclin-1和P62表达情况;比较不同LC-3、Beclin-1和P62表达情况患者基础、临床及病理资料差异。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 癌组织与癌旁组织LC-3、Beclin-1和P62表达情况比较

癌组织LC-3、Beclin-1阳性率低于癌旁组织,P62表达阳性率高于癌旁组织(P<0.05),见表1。

表1 癌组织与癌旁组织LC-3、Beclin-1和P62表达情况比较(例,%)

2.2 LC-3、Beclin-1和P62不同表达情况患者基础、临床及病理资料差异比较

LC-3、Beclin-1和P62不同表达情况患者肺癌病理类型、TNM分期以及分化程度差异均有统计学意义(P<0.05),性别、年龄、吸烟饮酒史、肿瘤直径、淋巴结转移、远处转移差异均无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 不同癌组织LC-3、Beclin-1、P62表达情况患者基础、临床及病理资料差异比较

3 讨论

NSCLC为肺癌的最常见类型,相较于小细胞肺癌,NSCLC癌细胞增殖扩散速度相对较慢,早期多无典型症状,若及时诊断发现并通过手术及放疗等规范治疗后则有极大治愈可能[5]。若NSCLC未能及时发现治疗,待中晚期诊断后,则需结合病情、病理类型和分期等多个因素综合评估,以制定针对性的手术、放化疗及靶向治疗等综合性治疗方案[6]。因此,NSCLC患者癌肿发生发展及临床病理特征的早期评估,对于患者后续病情控制及治疗方案的选择均有重要的指导意义。部分学者指出,肺癌的发病和病情发展可能与机体自噬功能异常相关,因而部分自噬相关蛋白表达变化对肺癌早期病情评估具有一定的参考价值[7]。

本次研究结果显示,NSCLC患者癌组织LC-3、Beclin-1阳性率低于癌旁组织,P62表达阳性率高于癌旁组织,同时不同LC-3、Beclin-1和P62表达情况患者肺癌病理类型、TNM分期以及分化程度均存在较大差异,说明LC-3、Beclin-1和P62表达情况与NSCLC患者病理类型、TNM分期以及分化程度由密切联系,其LC-3、Beclin-1表达降低及P62表达提升与肺癌的发生发展相关。LC-3主要存在于细胞质中,在细胞自噬过程中会定向结合到自噬囊泡膜上,其表达和定位与细胞自噬活性及水平均有密切关联。相关研究表明LC-3在肿瘤、神经退行性疾病和感染等多种疾病中均扮演重要角色,主要通过调控LC3的表达和修饰状态,影响细胞自噬的进程,从而对疾病的发生和发展产生影响[8];而在NSCLC的发生发展中,LC-3的表达下调使得自噬体生成减少,细胞自噬活性显著下降,而癌细胞的易感性提升,进而促进癌肿的发展转移,尤其在中晚期及低分化NSCLC中其活性降低更为明显。同时,王璁等[9]关于LC-3在NSCLC中表达的相关研究中也证实,LC-3在肺鳞癌中的阳性表达率高于其在腺癌中的表达率,与本次研究结果一致。Beclin-1为自噬过程中关键的蛋白质,参与调控自噬囊泡的形成和自噬的启动,低表达或缺失Beclin-1会导致自噬功能受损,从而可能影响细胞代谢、清除异常蛋白质和细胞器以及维持细胞稳态等重要生理过程;而在NSCLC患者中,机体Beclin-1表达减少或缺失导致其自噬功能显著降低,自噬体生成显著减少,癌细胞的自噬能力降低,异常细胞难以正常凋亡,导致癌细胞增殖失控,最终导致NSCLC的发展扩散,而随着肿瘤的分化程度降低,其表达水平进一步下降,在癌肿晚期及低分化NSCLC中,Beclin-1甚至完全失活,抑癌功能完全丧失,导致癌细胞侵袭及转移功能显著提升[10-11];但其在肺腺癌和鳞癌中的差异目前相关研究结果尚存在较大区别,需进一步扩大研究样本深入探讨[12]。P62作为机体另一个重要的自噬调控因子,在细胞内主要起着桥梁的作用,连接了自噬过程和其他细胞信号通路,通过与聚集的异常蛋白质或细胞器结合,将它们定向到自噬囊泡中进行降解,同时还可以作为信号分子,参与调节细胞生长、炎症反应和氧化应激等多种细胞过程,而异常的P62表达或功能可能导致自噬功能紊乱和细胞内废弃物的积累,从而对NSCLC的发生和发展产生影响[13-14]。王璁等[9]的研究还证实,P62在肺腺癌中的表达远高于肺鳞癌患者,同时其表达与NSCLC的病理类型、临床分期及转移情况均有密切关联。因此,临床可根据对于LC-3、Beclin-1和P62等自噬相关蛋白表达情况的测定,进一步明确NSCLC的发生发展情况。

综上所述,LC-3、Beclin-1表达降低及P62表达升高与NSCLC的发生和进展有密切关联,临床可作为NSCLC评估的辅助指标,为后续治疗方案的选择提供理论参考。