lncRNA SNHG6在鳞状食管癌组织中的表达及其临床意义

尚自强 张殿宝 张灿斌 李纪远 王 献 郑帅玉

食管癌(esophageal carcinoma,EC)是我国常见的消化道肿瘤,其发生率近年高居不下[1-2]。其中大部分EC是鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC),该疾病具有男性发病多、中晚期进展快、发病年龄普通大于40周岁、早期症状与其他疾病重叠等临床特点[2-3]。虽然随着医疗技术的发展,更多的ESCC得到针对性治疗,但其5年生存率仍低于30%[4-5]。因此,寻找ESCC新的靶点和治疗方案迫在眉睫。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的内源性非编码RNA,在细胞周期、分化等调控中发挥重要作用[6]。因此,lncRNA的异常表达可能影响癌基因或抗癌基因的表达、肿瘤细胞的生长、侵袭或/和转移等生理病理过程。小核仁RNA宿主基因6(SNHG6)是位于染色体8q13.1的新lncRNA,可通过和多种miRNA结合,调控其表达水平来参与肿瘤的发生[7]。近期刘方舟等[8]发现,lncRNA SNHG6通过结合mTOR和FAF2,增强和促进mTOR信号通路关键蛋白至溶酶体的激活,从而加速胆固醇驱动的肝癌的发展。但目前鲜有lncRNA SNHG6在ESCC中表达和机制的报道。因此本研究拟采用一系列PCR方法检测ESCC中lncRNA SNHG6的表达水平,并分析其与临床病理特征的相关性,以此为ESCC临床诊断和治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

筛选2020年2月至2022年2月于本院诊治的鳞状食管癌患者资料,将符合标准的96例纳入本研究。其中男性50例,女性46例;年龄46～75岁,平均(62.18±3.45)岁;肿瘤<5 cm 47例,≥5 cm 49例;TNM Ⅰ～Ⅱ期37例,Ⅲ～Ⅳ期59例;低分化49例,中、高分化47例;家族肿瘤史18例,吸烟史20例,饮酒史20例。

纳入标准:本院首诊,并通过病理检查确诊鳞状食管癌;均行根治切除术,且癌组织和癌旁组织(癌灶边缘5 cm外的组织)保存完好;无既往化疗、放疗及免疫等治疗经历;无其他免疫系统疾病,不合并其他恶性肿瘤;自愿加入本研究,且签署知情同意书。

本研究经本院伦理会批准,全部取样和实验均在监督下进行。

1.2 主要试剂

总RNA提取试剂TRIzol、反转录试剂盒购自美国Thermo公司,qPCR购于爱博泰克公司,SNHG6和GAPDH引物由南京金斯瑞生物公司合成。

1.3 样本处理

从手术获取样本后,立即将样本剪碎并加入Trizol浸没样本,用匀浆仪进行匀浆处理,离心后取上清去除杂质,转移至无RNA酶的EP管中,使用RNA抽提试剂盒提取总RNA。如样本不是立即抽提RNA,则置于-80 ℃保存待用。

1.4 指标检测

SNHG6在正常食管组织中表达情况:通过UALCAN分析工具(http://ualcan.path.uab.edu/)搜索并获取TCGA数据库中食管组织SNHG6表达量数据。

SNHG6在ESCC及癌旁组织中的表达情况:采用qPCR法检测样本组织中SNHG6表达水平。首先在OD260/280下测定抽提的总RNA浓度,按照反转录试剂盒说明书使用RNA,在25 ℃ 5 min、40 ℃ 60 min、75 ℃ 5 min的条件下制备cDNA。随后以此cDNA为模板进行PCR扩增,扩增调节:95 ℃预变性10 min;95 ℃变性5 sec、60 ℃退火32 sec、72 ℃延伸30 sec,共进行40个循环,72 ℃延伸5 min。扩增完成后,根据荧光信号到达阈值的循环数计算各空的Ct值,通过2-ΔΔCt法计算相对表达量,重复3次。以GAPDH作为参照。

1.5 数据分析

2 结果

2.1 TCGA数据库中SNHG6在ESCC及正常食管组织中的表达情况

应用UALCAN在线工具对数据库中SNHG6在ESCC和正常食管组织中表达水平的分析发现,ESCC组织中SNHG6表达水平(1.60±0.41)明显高于正常食管组织(0.08±0.06)(t=12.59,P<0.0001),见图1。

图1 数据库中SNHG6在正常食管组织及ESCC中的表达情况

2.2 SNHG6在ESCC及癌旁组织中的表达情况

qPCR检测显示,96例ESCC组织中SNHG6 mRNA表达水平(1.40±0.65)显著高于癌旁组织(0.17±0.15)(t=17.93,P<0.0001),见图2。

图2 SNHG6在ESCC及癌旁组织中的表达情况

2.3 SNHG6表达与ESCC患者临床病理特征的相关性分析

本研究将所有ESCC患者相对表达临界阈值定为1,相对表达>1为高表达,≤1为低表达。SNHG6表达水平与ESCC患者性别、年龄、吸烟史和家族肿瘤史无关(P均>0.05),与TNM分期(χ2=12.834,P<0.0001)、分化程度(χ2=15.886,P<0.0001)和饮酒史(χ2=4.051,P=0.044)相关,见表1。

表1 SNHG6表达与ESCC患者临床病理特征的相关性分析

3 讨论

研究表明,95%以上的EC是ESCC或腺癌,同时这两种不同的EC具有不同的临床特征,具体差异体现在肿瘤位置和易感因素[9-10]。ESCC主要危险因素是吸烟和饮酒[11-12]。由于早期症状轻微,或与其他食管相关疾病症状重叠,因此ESCC难以在早期被发现。同时,这种癌症的治疗是世界性难题。因此,寻找针对的标志物势在必得。lncRNA是一类无开放阅读框的RNA分子。虽然其不具有编码蛋白的能力,但lncRNA被证实在染色质重塑、mRNA降解、蛋白翻译后修饰等多个重要节点调控肿瘤发生和发展[13]。因此,lncRNA失调可能与恶性肿瘤进展密切相关。

SNHG6,也称U87HG,可通过和多种miRNA结合,以调控其表达水平来参与肿瘤的发生和发展[14]。2016年Chang等人首次证实,SNHG6在肝细胞癌中过表达,并能够通过诱导上皮细胞向间质转化促进肿瘤生长和转移,被认为具有重要[15-16]。但在ESCC中的表达及其临床价值探讨少有。为了明确SNHG6在ESCC中是否存在表达异常,本研究首先在TCGA数据库中分析了SNHG6的表达水平。结果显示,与正常食管组织相比,SNHG6在ESCC癌组织中表达水平明显更高。这说明,SNHG6可能与ESCC的发生发展相关。为了验证这一猜想,本研究通过qPCR法检测了96例ESCC患者根治术中获取的癌组织及癌旁组织样本中的SNHG6表达水平。结果显示,SNHG6在ESCC组织中的表达水平明显高于癌旁组织。这一结果印证了上述猜想,也提示SNHG6的表达水平在ESCC发展中上调。同时,其可能影响EESCC细胞的生物学功能,并可能成为ESCC诊断的分子标志物。

随后,本研究分析了SNHG6与ESCC患者临床症状的相关性。上述研究发现,癌旁组织SNHG6表达水平最高为1.030,正常食管组织这一值为0.18,癌组织中SNHG6表达量的95%CI为1.278～1.766。所以本研究将所有ESCC患者相对表达临界阈值定为1。进一步分析发现,表达水平高于1的患者更多出现于TNM Ⅲ～Ⅳ期,或肿瘤中、高分化,或具有饮酒史患者中。这说明,SNHG6可能参与肿瘤的转移和侵袭。但由于本研究纳入近年病例,随访时间不足,未探究SNHG6与患者预后、生存率等近远期指标间的相关性。因此在下一步的研究中,将延长研究时间,分析SNHG6与近远期预后之间的相关性。

综上所述,SNHG6在ESCC组织中呈高水平表达,其高表达与ESCC患者TNM分期、分化程度和饮酒史密切相关,可作为分子标志物为早期诊断和预后判断提供基础。