前列腺素D2 调控自噬影响胃癌干细胞的干性

田恒金，汪非凡，高培垚，陈阿敏，王 娜，张 强

（1.蚌埠医科大学第一附属医院检验科，安徽 蚌埠 233004；2.海军军医大学第一附属医院输血科，安徽 蚌埠 233004；3.蚌埠医科大学肿瘤基础研究与临床检验诊断重点实验室，安徽 蚌埠 233004）

胃癌（gastric cancer，GC）是严重危及人类健康的恶性肿瘤，胃癌的发病率和死亡率居世界恶性肿瘤的第五位和第四位［1］。目前，胃癌仍是我国第三大癌症死亡原因［2］。随着肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）理论的快速发展，人们逐渐认识到具有高致瘤性的CSCs 是肿瘤（包括GC）发展、复发、转移和耐药性的来源。CSCs 具有无限增殖和自我更新的能力，能促进肿瘤的快速生长［3］。有研究者认为GCSCs 由胃组织中正常干细胞或祖细胞转化而来［4，5］。此外，也有研究者通过无血清培养出一种球形的细胞，它具有自我更新能力和多向分化能力，经鉴定推测可能是肿瘤干细胞［6］。本课题组前期通过无血清培养技术分离并鉴定出GCSCs 和AGSGCSCs［5，7］，而 无 血 清 悬 浮 培 养 技 术 被 认 为 是 获 取GCSCs 最 便 捷 的 方 式［8］，并 可 用 于 后 续 实 验。PGD2 是一种脂质激素类信号配体，衍生自花生四烯酸具有生理活性的脂质化合物［6］，PGD2 合成酶（L-PTGDS）是PGD2 合成的关键酶。L-PTGDS 的表达可以间接反映PGD2 的分泌，同时它在一定程度上能够限制PGD2 的合成［9］。有研究报道PGD2可抑制胃癌细胞的生长和迁移能力［9，10］，但目前关于PGD2 抑制GCSCs 干性的具体机制并无报道。

自噬可以通过去除受损或老化的细胞器，以及恢复错误折叠和受损的蛋白质来维持细胞内环境的稳定性，它是哺乳动物中一种高度保守的自我防御机制［11-13］。此外，自噬在肿瘤细胞代谢应激，药物治疗或辐射损伤中维持细胞完整性的重要机制［14］，因此自噬在肿瘤中起重要作用。在自噬途径中Beclin-1 起着关键作用，通过降解自噬相关蛋白Beclin-1，可以抑制自噬，促进体内外肿瘤的发生和增殖［15］。在本研究中发现PGD2 可以促进胃癌细胞Beclin-1 蛋白上调，激活自噬。因此本研究通过探究PGD2 激活自噬，从而影响GCSCs 的干性，以期为胃癌的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂

人胃癌细胞系SGC-7901 由上海中科院细胞库提供，前列腺素D2（PGD2 批号：23Z293-D1，上海甄准公司），氯喹（Chloroquine，CQ，批号：159402，上海皓元生物医药科技有限公司），青-链霉素双抗（100×）（中国Biosharp 公司），一抗OCT4、CD44、Beclin-1、GAPDH、LC3、二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）。RPMI-1640 培养基（批号：8123209）、DMED/F12 培 养 基（批 号：8122453）、B27（美 国Gibco 公司），CD44 流式抗体（美国BD Biosciences公司），RIPA 裂解液，PMSF（100 mmol/L），胎牛血清（杭州天杭生物科技公司），BCA 蛋白定量试剂盒（批号：020123230413，上海碧云天生物技术有限公司），碱性成纤维细胞生长因子（basic fibrolast growth factor，bFGF）和表皮细胞生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）（美国Pepro Tech 公司），超低吸附6 孔板（美国Corning 公司）。

1.2 胃癌细胞及GCSCs 的培养

将胃癌细胞SGC-7901 用含10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗的RPMI-1640 培养基培养，置于37 ℃和5% CO2培养箱内孵育。培养2～3 d 进行传代或进行后续实验。将对数生长期的SGC-7901 细胞用胰酶消化，收集到离心管并加入无血清培养基后，以每孔计数1×104个细胞接种到超低吸附6 孔板中，其中无血清培养基中含有10 μL/mL B27，10 ng/mL bFGF，20 ng/mL EGF，培养体系为2 mL/孔。培养7～10 d，富集7901-GCSCs 进行后续实验。

1.3 流式细胞术检测干细胞标志物CD44 的阳性率

采用流式细胞术对无血清悬浮培养的7901-GCSCs 干细胞干性标志物CD44 的阳性率进行检测。分别收集贴壁培养的胃癌细胞SGC-7901 以及无血清培养的7901-GCSCs，分别计数20×104个细胞，随后转移至流式管再加入1.5 μL 的CD44 流式抗体，在冰上孵育15～30 min，最后每管加入500 μL的PBS 混匀后上机检测。

1.4 干细胞成球实验

将DMSO 组、PGD2 组细胞用胰酶消化后计数，在超低吸附6 孔板中以每孔200 个细胞密度培养，每孔加2 mL 培养基，7 d 后观察各组7901-GCSCs 的大小和数量并计数（直径＞40 μm 的细胞球）。

1.5 实验分组

将SGC-7901 进行无血清悬浮培养，先将富集的7901-GCSCs 分为：DMSO 组、PGD2 组（2.5、5、10） μg/mL。再 将 富 集 的7901-GCSCs 分 为：（1）DMSO 组、PGD2 组（2.5、5、10） μg/mL；（2）DMSO组、CQ 组（2.5、5、10） μM；（3）DMSO 组、PGD2 组、PGD2+CQ 组，PGD2 组 中PGD2 的 浓 度 为5 μg/mL，PGD2+CQ 组 中PGD2 和CQ 的 浓 度 分 别 为5 μg/mL 和5 μmol/L。

1.6 Western blot 检测OCT4、CD44、LC3、Beclin-1等相关蛋白表达量

采用Western blot 技术检测DMSO 组和PGD2组中OCT4、CD44 干性标志物和LC3、Beclin-1 相关自噬蛋白的表达。检测DMSO 组、PGD2 组、PGD2+CQ 组中OCT4、CD44 干性标志物和LC3、Beclin-1 相关自噬蛋白的表达。用裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）裂解并提取各组总蛋白，进行BCA蛋白定量，利用SDS-PAGE 胶进行电泳，随后将蛋白条带转移到PVDF 膜上。用脱脂牛奶封闭1～2 h，一 抗 比 例Beclin-1、LC3、OCT4、CD44（1∶2 000），GAPDH （1∶3 000）。在4 ℃冰箱摇床过夜。TBST洗膜3 次，每次10 min，随后加入二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，TBST 洗膜3 次之后ECL 显影，检测蛋白质条带。

1.7 统计学处理

采用Graphpad prism 8 进行统计分析和作图，各实验均重复3 次以上。两组间比较采用独立样本t检验，多组之间的比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 7901-GCSCs 的培养及鉴定

正常培养的胃癌细胞SGC-7901 和无血清悬浮培养的7901-GCSCs 生长形态，如图1A、B。采用流式细胞术检测SGC-7901 和7901-GCSCs CD44 的阳性率，结果显示，与正常SGC-7901 相比，7901-GCSCs 中干性标志物CD44 的阳性率明显增加（P＜0.05），如图2A～C。表明成功富集了带有干细胞特性的7901-GCSCs。

图1 SGC-7901 和7901-GCSCs 生长形态Fig 1 SGC-7901 and 7901-GCSCs growth forms

2.2 PGD2 抑 制7901-GCSCs 的 干 性

采用倒置显微镜观察加入不同浓度的PGD2（2.5、5、10） μg/mL 刺激7901-GCSCs 细胞的成球形态。实验结果表明，与DMSO 组相比，5 μg/mL、10 μg/mL 浓度的PGD2 刺激的7901-GCSCS 细胞，细胞球数量明显减少（P＜0.05），并呈浓度依赖性，如图3A、B。此外，Western blot 结果显示，与DMSO组相比，PGD2 组中干性标志物（CD44、OCT4）蛋白也呈浓度依赖性表达下调（P＜0.05），如图4A～C。上述实验结果表明PGD2 抑制了7901-GCSCs 的干性。

图3 PGD2 刺激后7901-GCSCs 的成球能力减弱Fig 3 Ball-forming ability of 7901-GCSCs is diminished after PGD2 stimulation

图4 PGD2 刺激后7901-GCSCs 中CD44、OCT4 的表达降低Fig 4 Decreased expression of CD44， OCT4 in 7901-GCSCs after PGD2 stimulation

2.3 PGD2 促进7901-GCSCs 自 噬的活 化

采用Western blot 检测加入不同浓度的PGD2（2.5、5、10） μg/mL 刺激7901-GCSCs 细胞的蛋白表达，结果显示，与DMSO 组相比，PGD2 组中自噬相关标志物（LC3、Beclin-1）的蛋白表达上调（P＜0.05），并呈浓度依赖性，结果表明PGD2 能够激活自噬，如图5A～C。

图5 PGD2 刺激后7901-GCSCs 中LC3、Beclin-1 的蛋白表达增加Fig 5 Increased protein expression of LC3 and Beclin-1 in 7901-GCSCs after PGD2stimulation

2.4 CQ 抑 制7901-GCSCs 自 噬 的活化

采用Western blot 检测加入不同浓度的CQ（2.5、5、10）μmol/L 刺激7901-GCSCs 细胞的蛋白表达，结果显示，与DMSO 组相比，CQ 组的自噬相关标志物（LC3、Beclin-1）蛋白表达下调（P＜0.05），结果表明CQ 能够抑制自噬，如图6A～C。

2.5 PGD2 对7901-GCSCs 自噬水平和干性的影响能被CQ 所抑制

采用Western blot 检测加入5 μg/mL 的PGD2和5 μmol/L 的CQ 刺激7901-GCSCs 细胞的蛋白表达，结果显示，与DMSO 组相比，PGD2 组中干性标志物（CD44、OCT4）蛋白表达明显下调，自噬相关蛋白（LC3、Beclin-1）的蛋白表达上调（P＜0.05），如图7A、B。而与DMSO 组相比，PGD2+CQ 组中细胞自噬相关蛋白以及干性标志物表达并无明显变化。（ns：差异不显著）如图7A、B，上述实验结果表明CQ 可阻断PGD2 对7901-GCSCs 的干性抑制作用。

图7 CQ 阻断PGD2 对7901-GCSCs 的干性抑制作用Fig 7 CQ blocks the stemness inhibition of 7901-GCSCs by PGD2

3 讨论

胃癌仍然是目前全球最常见的肿瘤之一，据报道2020 年全球胃癌新发病例100 多万例，死亡近80万例［1］。而CSCs 被又称为肿瘤的“起始细胞”，极少数的CSCs 即可诱导肿瘤的发生［16］，肿瘤干细胞与肿瘤的血管生成、耐药性、侵袭性等密切相关［17］。同时CSCs 的存在也是肿瘤耐受放化疗的重要机制［18］。有研究者认为GCSCs 是胃干细胞（Gastric stem cells，GSCs）的突变，引起正常胃癌组织从萎缩性胃炎、肠化生、不典型增生，最后发展到胃癌［19］。也有研究表明在GCSCs 形成过程中，往往伴有细胞的上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）发生和干细胞特异性基因的高表达［20，21］，因此，分离和鉴定出干细胞特异性基因对靶向治疗GCSCs 至关重要。目前，靶向药物针对GCSCs 的调控机制尚不明确，还需要进一步的探究。PGD2 是由花生四烯酸的通过一系列酶促反应，随后在环氧化酶（cyclooxygenase，COX）的作用下，分解成中间产物前列腺素H2，最后在L-PTGDS 作用下转化PGD2［22］。目前国内外针对PGD2 的研究主要集中在对炎症和哮喘等免疫系统疾病的研究，而对肿瘤方面的研究较少。Kim 等［23］发现肿瘤间质细胞来源的PGD2 可以抑制前列腺癌细胞的生长。肥大细胞来源PGD2 能抑制肺癌组织血管生成和肠炎诱导的肿瘤发生［22，24］。课题组前期研究发现PGD2影响GCSCs 生物学功能［6］。因此，本研究进一步探究PGD2 影响GCSCs 干性的分子机制，以期为临床胃癌的诊疗提供新的思路和靶点。

自噬一般被认为是一种细胞自食的过程，它是将细胞质内的成分通过隔离并封闭在囊泡（自噬体）内，随后与溶酶体结合成为自噬-溶酶体并降解其中包含的物质［25］。在肿瘤发展过程中，自噬具有双重作用：一方面，它通过诱导肿瘤细胞的自噬性死亡来实现对肿瘤抑制作用；另一方面，它可以有助于肿瘤转化和增强其化学抗性［26］。最近的研究表明，干细胞的自我更新和分化依赖于自噬的激活［27，28］。而激活自噬能够促进CSCs 的增殖和耐药，对CSCs 的恶性生物学功能是必不可少的［29］。然而，在本研究中通过PGD2 的刺激后，Western blot结果显示，与DMSO 组相比，自噬相关蛋白LC3、Beclin-1 蛋白表达成浓度依赖性增加，而干性指标OCT4、CD44 的蛋白表达也是成浓度依赖性降低，表明PGD2 能够激活自噬，同时抑制GCSCs 的干性。

有研究报道PGD2 和L-PTGDS 可能通过PPARγ 信号通路抑制胃癌的发生、转移、侵袭和增殖［30］。本实验通过干细胞成球和Western blot 实验结果表明，PGD2 对干细胞成球能力的抑制作用成浓度依赖性，随着PGD2 浓度越高，成球能力越弱，并且PGD2 抑制干性相关蛋白的表达。CQ 是一种自噬抑制剂，它能抑制自噬体与溶酶体的融合［31］。Zhao 等［32］通过使用CQ 阻断AQP5 对自噬的激活作用，从而进一步说明AQP5 可能是通过自噬调控GCSCs 的生物学功能。而在本研究中通过CQ 能否阻断PGD2 对自噬的激活，探究PGD2 可能通过自噬影响胃癌干细胞的干性。因此在本研究发现PGD2 能促进7901-GCSCs 自噬相关蛋白的表达的同时，PGD2 对7901-GCSCs 干性抑制作用能被自噬抑制剂CQ 所阻断。说明PGD2 可能是通过调控自噬影响GCSCs 的干性。然而，在本实验中只是说明了PGD2 可能是通过自噬影响GCSCs 的干性，但具体调控自噬的分子机制需要进一步探究。

简而言之，外源性的PGD2 能够抑制7901-GCSCs 的 成 球 能 力，PGD2 对7901-GCSCs 干 性 的 抑 制作用能被自噬抑制剂CQ 所阻断，表明PGD2 可能通过自噬来抑制GCSCs 的干性。

作者贡献度说明：

张强：研究指导及文章审核；汪非凡：负责相关实验、分析数据以及论文修改；高培垚：实验指导以及论文修改；田恒金：撰写论文； 陈阿敏、王娜：文献收集分析。

所有作者声明不存在利益冲突关系。