基于Au-Ag 合金的EC-SERS 光谱监测多巴胺氧化还原反应

王 康，刘 官，张 磊

（南京邮电大学，江苏 南京 210000）

多巴胺是一种天然化合物，在神经系统和心血管系统中发挥重要作用。多巴胺不仅负责控制释放各种激素，而且还在血管和肾脏中发挥许多功能[1]。神经系统的一些疾病与多巴胺系统的功能障碍或缺乏有关[2]。

金属纳米粒子因其优异的光学、电学和磁学特性而被用于催化、医学和工业等领域[3]。采用柠檬酸钠还原法制备的Au-Ag 纳米粒子既具有Au 纳米粒子稳定的SERS 增强效果又具有Ag 纳米粒子的SERS 高灵敏度，在SERS 研究中具备一定优势[4]。SERS 是一种很有前途的技术，可用于超灵敏化学检测、生物分析和诊断以及生物医学应用[5-9]。并且已广泛用于检测生命系统中的生物物种。同时电化学表面增强拉曼散射（EC-SERS）通常是测量以化学或物理方式吸附到电极表面的分子或离子的拉曼光谱，并监测通常由于施加的电压或电流引起的某些扰动影响下的变化。这些变化可以明显揭示分子的完全吸附/解吸或它们向其他物种的（电）化学转化[10-11]。多巴胺及其相关化合物还可在体外清除自由基，并在体内显示出神经保护作用。它们表现出复杂的氧化还原特性，通过在温和的还原条件下释放质子和电子，快速氧化自转化为醌形式[12]。尽管已经报道了多巴胺与量子点的相互作用[13-16]，但人们对使用EC-SERS 光谱的纳米颗粒表面上的多巴胺和多巴胺-醌的性质尚了解不多。

在现有的技术启发下，本文计划合成具有高SERS 响应的Au-Ag 合金纳米颗粒（Au-Ag NPs）用于构建SERS 基底，并通过电化学和SERS 结合的方法来监测Au-Ag NPs 表面多巴胺氧化还原态（苯酚-苯醌）的光学性质，发现在1270、1335 和1455 cm-1处的SERS 特征峰强度可受H2O2和GSH调制而变化。此外，通过恒电位法探究了多巴胺在电极上氧化还原的电位依赖性变化过程，验证了吸附在电极上的多巴胺随着电极表面施加的电势而发生可逆变化，以期达到为研究其氧化还原性质提供了新的证据的目标。

1 实验

1.1 试剂和仪器

试剂：氯金酸（49%，AR）、柠檬酸钠（99.5%，AR）、4-巯基苯甲酸（99%，AR）均购自阿拉丁生化科技有限公司，硝酸银（99.8%，AR）、浓盐酸（AR）、无水乙醇（AR）、谷胱甘肽（98%，AR）、过氧化氢（25%）均购自国药集团化学试剂有限公司，多巴胺（98%，AR）、3-巯基丙基三甲氧基硅烷（95%，AR）均购自德国默克集团。除特别说明外，所用药品均为分析纯。

仪器：UV3600 紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；FEI Tecnai G2 F20 高分辨透射电子显微镜，美国FEI 公司；HY-E-1001A/B 恒电位仪，上海辰华仪器有限公司；Eclipse Ti-U 暗场显微镜，日本尼康公司；ARC-LDS 拉曼光谱仪，美国TELEDYNE技术公司。

1.2 Au-Ag 合金纳米颗粒的制备

金银合金纳米颗粒制备按照文献方法[4]改进为：在两颈烧瓶加入77.5 mL 超纯水于120℃的恒温油浴锅中加热，当瓶内超纯水沸腾时，向反应瓶中加入1 mL 0.01 M AgNO3和1 mL 0.01 M HAuCl4，加热并搅拌约10 min 后，迅速向溶液中加入8 mL 1%的柠檬酸钠，在搅拌下继续加热15 min，溶液逐渐变成橙红色，自然冷却至室温得到金银合金纳米颗粒。将制备得到的金银合金纳米颗粒以3500 r/min 的速度离心15 min 后取上清液，然后加入超纯水稀释到与原先相同体积并超声10 min 后再以6500 r/min 的速度离心15 min 后保留沉淀并稀释。收集到的金银合金纳米颗粒储存在4℃下密封避光保存备用。

1.3 Au-Ag 合金SERS 基底的制备

将1.5 mL 3-巯基丙基三甲氧基硅烷（MPTS）用35 mL 乙醇稀释，接着与洗净的ITO 玻璃片一同放入离心管中在超声波清洗机中超声15 min 后静置2 h 以上。接着取出玻璃片，用乙醇冲洗多次清除未吸附的MPTS，然后用超纯水再冲洗多次去除表面的乙醇，最后将玻璃片放入干净的容器内并一同放入电热恒温鼓风干燥箱内烘干后密封保存。

先前制备好的金银合金纳米颗粒加入到离心管中在6500 r/min 下离心10 min 去除上清液，向剩余的浓缩颗粒中加入2 μL 超纯水并放入超声波清洗机中超声10 min 使其完全分散均匀。取一片MPTS 功能化的ITO 玻璃片用万用表测量电阻确定其导电面，将2 μL 的浓缩金银合金纳米颗粒滴加在ITO 玻璃导电面上并室温下蒸发直至干燥。所有ITO@MPTS@Au-Ag 样品在使用前储存在惰性气体中以确保清洁。

1.4 仪器表征

用紫外-可见分光光度计观察Au-Ag 合金纳米颗粒的紫外峰位置，用高分辨透射电子显微镜观察Au-Ag 合金的微观形貌并用配套的EDS 进行元素分析，用场发射扫描电子显微镜和暗场显微镜观察Au-Ag 合金纳米颗粒制备的SERS 基底的形貌，用恒电位仪对多巴胺进行循环伏安测试，用拉曼光谱仪测试SERS 基底上多巴胺的拉曼峰变化。

1.5 对SERS 基底进行可重复性测试

配置30 mL 1×10-6M的4-巯基苯甲酸（4-MBA）溶液，取出制备好的Au-Ag 合金SERS 基底ITO 玻璃片，将玻璃片浸入4-MBA 溶液中，2 min 后取出玻璃片，用氮气吹干表面残留溶液，将玻璃片放置在拉曼光谱仪上，在SERS 基底上不同位置下记录SERS 光谱，积分时间为5 s 对其平行采集SERS 光谱多次。

2 结果与讨论

2.1 Au-Ag 合金纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱

固定 HAuCl4浓度并采用不同 HAuCl4和AgNO3配比，合成了三种直径约为40 nm Au-Ag NPs，其紫外-可见（UV-vis）吸收光谱如图1a 所示。与文献报道的40～45 nm 金纳米颗粒胶体的吸收峰（529 nm）相比较，随着AgNO3的摩尔比例的增加，金银合金纳米颗粒吸收峰位置从左到右分别为423 nm、478 nm 和512 nm，发生了显著红移，这一结果可推断主要由于银原子掺杂比例改变引起。

图1 a. Au-Ag 合金紫外-可见吸收光谱；b、c 和d. 三种比例的Au-Ag 合金纳米颗粒TEM；e、f 和g. 相应的粒径分布图

2.2 Au-Ag 合金纳米颗粒的高分辨透射电子显微镜表征和EDS 元素分析

分别通过TEM 和HRTEM 对采用不同反应物配比（摩尔比分别为3∶7、1∶1 和7∶3）的Au-Ag NPs 进行表征。如图1b、c 和d 所示，可以看出，合成的Au-Ag NPs 形貌良好且大小均一，其大小约为42 nm，同时也能看出明显的对比度，揭示了球形合金颗粒顺利形成。为了能够清晰明了的看出颗粒的粒径分布，通过ImageJ 软件对颗粒尺寸统计得出其对应的粒径分布图如图1e、f 和g 所示，Au-Ag NPs 的直径为42±6.4 nm，表现出较好的单分散特性，从而为后面构建良好的SERS 基底提供良好的材料。

为了更直观地了解Au-Ag NPs 中金和银元素的占比，对三个不同摩尔比的 Au-Ag NPs 进行HRTEM 表征和EDS 元素分析。由图2 可知，随着反应物AgNO3比例的增加，其产物Au-Ag NPs 中银含量（绿色）逐渐增加，而金含量（紫色）基本保持不变。从而直接验证了Au-Ag NPs 中银含量随反应物浓度增加的事实。不仅如此，从Au-Ag NPs的能量色散X 射线光谱（EDS）结果，可以得到类似的结果，如Ag-Au NPs（3∶7）中Au 和Ag 的质量比为1.88∶8.12，原子数比为2.99∶7.02。其他合成的不同摩尔比的样品，组成比与EDS 数据分析的结果也保持一致。

图2 a、b 和c 分别3∶7、1∶1 和7∶3 的Au-Ag 合金的HRTEM 图

2.3 Au-Ag 合金纳米颗粒的SERS 响应性探索

为了制备具有良好的SERS 响应的基底，利用咖啡环效应采用Au-Ag NPs 构建了均一的SERS 基底，图3a 是在暗场显微镜（DFM）下Au-Ag NPs的SERS 基底的图片，可见在暗场视野中玻璃片上形成了膜状结构且呈现大片均匀的金黄色，这表明SERS 衬底中颗粒具有极高的聚集度。图3b 所示的SEM 图像表明球形颗粒的平均直径约为42 nm。通过SEM 确定的纳米颗粒形态证明了它们的聚集行为。对比了SEM 和TEM 图像可以发现，Au-Ag NPs制备的SERS 基底形貌相对平整且具有极高的聚集度。值得一提的是，随着银含量的增加，其SERS 信号随之增强，表现出一定程度的正相关性，鉴于此结果，采用Au-Ag NPs（1∶1）构建的SERS 基底进行后序实验。

图3 Au-Ag 合金SERS 基底：a. 暗场显微镜图和b.SEM；c. SERS 基底上不同点处4-MBA 的SERS 光谱；d. 多巴胺在pH=6（下）和pH=10（上）的SERS 光谱

为了测试Au-Ag NPs（1∶1）构建的SERS 基底拉曼信号的重现性，将SERS 基底浸入浓度为1×10-6M 的4-MBA 溶液1 min 后，使目标分子与基底通过Au-S 结合在SERS 基底上并在拉曼光谱仪下进行SERS 检测。如图3c 所示，选取了6 个不同的位置测量特征位置的拉曼峰，每组选点均采用633 nm 波长的激光器在拉曼光谱仪下采集5 s，光谱以1069 cm-1和1577 cm-1处的拉曼峰为主，图中可以显著看出拉曼峰强度相对稳定，多次检测相对误差为7.4%，进一步表明基底具有很强的SERS 响应性和可重复性。

2.4 酸碱环境对多巴胺的SERS 光谱的影响

多巴胺-苯酚和多巴胺-苯醌之间的转化受不同酸碱度环境的影响较大，研究了Au-Ag NPs的SERS基底上多巴胺-苯酚和多巴胺-苯醌之间的拉曼光谱。使用拉曼光谱仪在633 nm 激发波长下采集Au-Ag NPs 的SERS 基底上多巴胺-苯酚（pH=6.0）和多巴胺-苯醌（pH=10.0）的拉曼光谱。如图3d 所示，可以明显看出，在一个随机选择的点（pH=6.0）处没有明显的金银合金联接多巴胺（Au-Ag@DA）的拉曼峰。在1270、1335 和1455 cm-1（pH=10.0）处明显观察到了Au-Ag@多巴胺-苯醌的特征拉曼峰。说明多巴胺在pH<8 的水溶液中以质子化形式存在。在酸性环境（pH=6.0）中，当质子化多巴胺（DA+）与带负电荷的Au-Ag NPs 结合时，颗粒的稳定性会受到严重破坏。因此，Au-Ag@DA 的SERS 强度收到极大减弱。然而，在碱性环境（pH=10.0）中，Au-Ag NPs 可以与更多去质子化的多巴胺分子结合，因此，该Au-Ag@多巴胺-苯醌结构显示出更好的SERS 光谱响应。

2.5 多巴胺在SERS 基底上的氧化还原转化

谷胱甘肽（GSH）作为一种强还原剂，可以化学还原Au-Ag NPs 上的多巴胺-苯醌。多巴胺-苯醌和GSH 之间的反应也是pH 依赖性的。当pH 值较低时，GSH 被质子化（硫醇形式），因此亲核性不足以与更丰富的水分子竞争。在高pH 条件下，GSH几乎完全以其高度亲核的硫醇盐形式（GS-）存在，并通过亲核加成将多巴胺-苯醌还原使其转化为多巴胺-苯酚。

如图4a 所示，随着GSH 浓度的增加，可以观察到多巴胺-苯醌的明显拉曼光谱变化。显然，当添加GSH 的浓度逐渐升高时，位于1270、1335 和1455 cm-1的Au-Ag@多巴胺-苯醌的拉曼峰强度显著降低。这表明多巴胺-苯醌可以很容易地被谷胱甘肽还原。图4b 展示了在1.0×10-6到1.0×10-5M 的范围内位于1335 和1455 cm-1的SERS 特征峰强度与GSH 浓度的关系，通过拟合发现SERS 强度与GSH 浓度基本呈线性关系，计算得其检测限（LOD）为5×10-7M。因此，显著的SERS 变化表明多巴胺-苯醌可以很容易地被GSH 在Au-Ag NPs 表面还原，表明Au-Ag@多巴胺-苯醌可以高灵敏定量GSH的浓度。

图4 a 和c. GSH 和H2O2 的多巴胺的SERS 光谱；b 和d. 对应的特征峰的线性拟合

同样的，过氧化氢作为一种强氧化剂，是生物体系中一种重要的生物化学反应分子，与超氧自由基具有相似的化学性质。因此，利用过氧化氢对多巴胺的强氧化能力在Au-Ag@DA 平台构建检测H2O2探针具有重要的研究意义。

如图4c 所示，随H2O2的浓度在基底上一个随机点处在1×10-6～1.2×10-5M 的范围内Au-Ag@DA的SERS 信号变化情况。当加入的H2O2浓度升高时，位于1270、1335 和1455 cm-1的Au-Ag@DA的拉曼峰强度显著增加，表明多巴胺-苯酚很容易被H2O2氧化。如图4d 所示，在1×10-6～1.2×10-5M 的范围内，H2O2浓度与在1335 cm-1和1455 cm-1处SERS 特征峰强度存在线性关系，计算得其LOD 为5×10-7M。这表明多巴胺-苯酚可以很容易地被H2O2在Au-Ag NPs 表面氧化。基于以上结果，Au-Ag@DA 显示出对GSH 和H2O2检测的高灵敏度，遵循Au-Ag NPs基底表面对多巴胺苯酚和苯醌之间的转化。

2.6 多巴胺在SERS 基底上的电位依赖性变化

从上述结果可以看出，多巴胺可以被氧化为苯醌结构，也可以被还原为苯酚结构。这一结果同样可以采用电化学方法进行验证。在电化学窗口0.30～ -0.40 V 范围内，利用循环伏安法进行扫描。从图5c 可以看出，多巴胺分别在0.16 V 和-0.18 V 处即可表现出显示的氧化还原峰，使其在氧化态（苯醌）和还原态（苯酚）之间转换。进一步在0.30 ～ -0.40 V 范围内不同电位下观察多巴胺的SERS 光谱，可以很清晰地看到位于1270、1335 和1455 cm-1波数的拉曼峰。当施加的电位相对于参比电极正向移动至0.3 V 时，1270、1335 和1455 cm-1处的SERS 强度逐渐降低，表明多巴胺-苯醌的减少。然而，当电势相对负向移动到-0.4 V 时，1270、1335 和1455 cm-1处的拉曼峰又再次出现，这表明多巴胺在Au-Ag 合金基底表面重新氧化，并且当还原过程发展时，这些特征带也消失了。如图5d 所示，连续多次使电位恒定在0.3 V 到-0.4 V 之间循环，多巴胺的SERS 光谱特征峰存在可逆的电位依赖性变化，进一步证明吸附在基底上多巴胺的状态可随电极表面施加的电位而可逆变化，这对于深入理解多巴胺反应动力学过程提供了依据。

图5 a 和b. 多巴胺SERS 光谱；c. SERS 基底上多巴胺的循环伏安图；d. 循环电位下多巴胺的SERS 光谱特征峰（参比电极Ag/AgCl）

3 结论

本文探究了一种Au-Ag NPs 的合成方法，并利用咖啡环效应，在ITO 导电玻璃片上构建了均一、重现性高、响应能力强的SERS 活性基底，4-MBA的SERS 信号验证了这一结论。同时，构建的Au-Ag NPs 多巴胺SERS 光谱平台在1270、1335 和1455 cm-1处的SERS 特征峰受H2O2和GSH 调制而变化，可用于构建GSH 或H2O2的生物传感器，其检测灵敏度均达到0.1 μM 水平。此外，该基底可作为EC-SERS 的工作电极，通过电化学和SERS 结合的方法在Au-Ag NPs 表面监测多巴胺（苯酚）和多巴胺（苯醌）两种氧化还原态的转换过程，证明了多巴胺在电化学作用下的可逆性，这对于深入理解多巴胺反应动力学过程提供了依据。