日粮添加黑水虻和螺旋藻对幼猫免疫功能的影响

2024-03-11庞晓玥许春荣叶嘉莉邱文粤章心婷苏依曼苏荣胜

中国饲料 2024年5期

庞晓玥，许春荣，叶嘉莉，邱文粤，章心婷，苏依曼，苏荣胜

（1.华南农业大学兽医学院, 广东广州 510642；2.广东原喵智能科技有限公司，广东顺德 528000）

幼猫是指6 月龄内的猫，在这个阶段的小猫身体各器官发育尚未完全，对外界刺激如寒冷、酷暑、暴风雨等天气的变化及饲养环境的转换反应能力差，适应能力弱；且由于缺乏自然免疫力，若不及时做好驱虫和免疫，容易导致幼猫染病或夭折（蒋珊珊等，2020）。研究表明，约有70%的免疫细胞位于消化道中（王昱丁等，2018），因此在满足幼猫基本营养需求、提供驱虫和免疫基础保障的同时，在日粮中添加能够激活免疫力和提高抵抗力的营养素对幼猫的健康生长和发育尤为重要。

黑水虻（Hermetia illucens）是一种腐生性的水虻科昆虫，出现于全球热带和温带地区。成年的黑水虻不咬人或叮人，且不传播任何特定疾病（Wang 等，2017）。它作为一种优质蛋白质替代品的同时，还富含多种微量和常量营养素。研究表明，其能够显著改善畜禽的肠道健康、增强机体免疫功能、提高抗氧化能力，从而提高抗病力（刘彬等，2023）。螺旋藻（spirulina，SP）属低等水生植物，是最早被人类食用的藻类，其含有非常丰富的蛋白质，以及人类和动物所需的必需氨基酸，并具有抗氧化、抗炎、抗癌、免疫调节等多种生物活性（刘晶等，2022）。本试验以黑水虻和SP 为日粮中的营养性添加剂，探究它们对幼猫生长性能、免疫功能以及抗氧化方面的影响，为其在保障幼猫健康生长发育中的实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计 18 只45 ~ 60 日龄断奶田园幼猫由海大威海宠物试验基地提供，免疫驱虫史完整，幼猫每日喂食两次，自由饮水，进行为期1 周的适应性饲养后正式试验24 d。试验在华南农业大学宠物医学研究中心进行，并由华南农业大学宠物医学研究中心负责日常饲喂管理。将18 只幼猫随机分为3 组，每组6 只。对照组幼猫饲喂某进口品牌幼猫粮（H 组）；试验组幼猫饲喂无谷鲜肉昆虫蛋白猫粮[基于空白对照组配方，额外添加黑水虻和螺旋藻，生产于海大宠物食品（威海）有限公司。 T 组]；空白对照组幼猫饲喂海瑞特75+幼猫猫粮[基础配方猫粮，生产于海大宠物食品（威海）有限公司。75+组]。在试验第24 天静脉采集幼猫血液各5 mL，离心后取血清进行相应检测并存至-80 ℃。

1.2 试验试剂和仪器猫免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM） ELISA试剂盒，购自Abcam；白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-2 （IL-2）、肿瘤坏死因子-α （TNF-α）ELISA 试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司；FPV、FHV 和FCV 抗体快速检测试剂盒，购自安捷产品生产公司。总超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒、过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒、总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒、丙二醛（MDA）检测试剂盒由南京建成生物研究所提供；Nanodrop-2000 型微量紫外分光光度计、MULTISKAN FC 型酶标仪由美国Thermo Fisher 公司提供；荧光定量检测仪由韩国安捷BIONOTE Vcheck 公司提供。

1.3 指标测定

1.3.1 平均日增重和平均日采食量试验第1 天早上开始称取每只猫的粮重量，在晚上喂食前称取白天剩余粮重量及新放粮的重量，并在第2 天早上称取前一晚粮剩余克数，直至试验开始后的第25 天。记录并计算每只猫的平均日采食量，计算公式为：平均日采食量=（早上粮重量-晚上剩余粮重量）+（晚上新放粮重量-第2 天早上粮剩余量）]/试验天数。

于正式试验第1 天及第24 天幼猫禁食2 h后，准确称量其空腹体重。计算每只猫的平均日增重，计算公式为：平均日增重=（试验结束时体重-试验开始时体重）/试验天数。

1.3.2 免疫力指标检测正式试验第24 天每只猫静脉采血5 mL，静置30 min 后以3000 r/min离心3 min，吸取上清液于新的EP 管，即为血清样品。测定的免疫功能指标包括Ig A、Ig G、Ig M、IL-6、IL-2 和TNF-α，具体操作按各试剂盒说明书进行。

1.3.3 猫三联抗体水平检测血清获得方法同1.3.2；测定的血清猫三联抗体水平种类包括FPV、FCV 和FHV；吸取5μL 血清样品加入测定稀释液管中充分混合，将检测试纸插入仪器槽中并加入100 μL 混合充分的样品到样品孔，等待仪器检测读取结果。

1.3.4 血清代谢组学检测不同猫粮对幼猫血清中代谢物的影响将血清样本从-80℃冰箱中取出，经过处理后运用超高效液相色谱质谱连用技术进行检测。色谱柱为Waters 的ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）。数据采用主成分分析（PCA）进行多元统计分析，随后采用正交二乘法-判别分析（OPLS-DA）的变量重要性投影（VIP），进行两两比较，筛选出有差异的代谢物。筛选标准为P＜0.05、VIP＞1，当差异代谢物同时满足这两个条件时，说明该代谢物的组间差异性显著。

1.3.5 血清抗氧化指标检测血清获得方法同1.3.2；测定指标包括SOD、CAT、T-AOC 和MDA，操作按试剂盒说明书进行。

1.3.6 粪便形状评分试验结束前一周，每天对粪便的质量进行评分，粪便评分过程由同一人进行评估，按照1 ～5 分制，评分标准见表1。

表1 粪便形状评分标准

1.4 数据分析结果以“平均值±标准差”形式表示，采用GraphPad Prism 8（GraphPad 软件，美国）进行单因子方差分析（one-way ANOVA）。在本研究中，“*”表示与对照组相比的组，“#”表示与空白对照组相比的组。其中P＜0.05 和P＜0.01 分别表示差异显著和差异极显著。

2 结果

2.1 日粮添加黑水虻和螺旋藻对幼猫生长发育的影响每组幼猫平均日增重如图1（a）所示，H组幼猫平均日增重23.3g；T 组幼猫平均日增重27.83g；75+组幼猫平均日增重25.31g。三组幼猫的平均日采食量如图1（b）所示，其中H 组平均日采食量61.97g；，T 组平均日采食量71.61 g；75+组平均日采食量65.55g。 T 组幼猫平均日增重和平均日采食量最高。

图1 各组平均日增重和平均日采食量对比

2.2 日粮添加黑水虻和螺旋藻对免疫功能指标的影响从图2（a）可以看出，与H 组相比，T 组的IgM 水平提高10.72%（P＜0.05）；而75+组与T组相比，IgM 水平下降了12.28%（P＜0.01）；IgA与IgG 水平三组相比则未见明显差异。由图2（b）可以看出，T 组和75+组的IL-6 和IL-2 水平均高于H 组，其中T 组IL-2 水平较H 组要显著增高22.53%（P＜0.01）。此外T 组的TNF-α 水平低于其他两组，且与75+组相比显著降低13.74%（P＜0.01）。

图2 各组免疫功能指标水平对比

2.3 日粮添加黑水虻和螺旋藻对猫三联抗体水平的影响如图3 所示，T 组的FCV 和FPV 抗体水平均高于75+组，且75+组的FCV 抗体水平较H 组显著降低47.5%（P＜0.05）。而FHV 抗体水平三组未见明显差异。

图3 各组猫三联抗体水平对比

2.4 日粮添加黑水虻和螺旋藻对幼猫血清中代谢物的影响首先对三组样本进行PCA 分析，由图4（a）可知，三组样本均位于95%置信区间内，且各组样本能较好地聚类在一起。使用OPLS-DA分析对三组样本进行两两比对分析并筛选出差异代谢物，由图4（b ～d）可得，在OPLS-DA 模型下各组样品分离明显，可进一步筛选差异代谢物。表2 为三组对比后筛选的差异代谢物，在本试验中与H 组相比，T 组的茶皂醇A、环丙甲酸B、马齿苋黄素II 和熊果酸有所上调，而75+组的甘油三酯也有所上调。与75+组对比，T 组的茶皂醇A、环丙甲酸B、马齿苋黄素II、熊果酸、13，14-二氢前列腺素-1α 和10，20-二羟基二十酸也有所上调。

图4 PCA（a）得分图和OPLS-DA 得分图（b ～d）

表2 三个试验组之间差异代谢物

2.5 日粮添加黑水虻和螺旋藻对血清抗氧化指标水平的影响从图5（a ～c）可以看出，T 组的SOD、CAT 和T-AOC 的活力水平最高，其次为H组，其中与75+组相比，T 组的T-AOC 水平升高极为显著（P＜0.01），升高了490%，而H 组与75+组相比也明显升高了303.23%（P＜0.05）。由图5d 可知，75+组的MDA 水平最高（P＜0.05）较H 组与T 组分别升高了80.85%和77.08%。

图5 各组抗氧化指标水平对比图

2.6 日粮添加黑水虻和螺旋藻对粪便形状的影响三个组的猫粪便形状评分如图6 所示，H 组幼猫平均粪便评分4.75 分，75+组幼猫平均粪便评分4.83 分，T 组幼猫平均粪便评分最高，为4.95 分，粪便形状良好，坚硬且干燥。

图6 各组猫粪便形状评分对比

3 讨论

随着养猫人数的激增（尤其是养幼猫的人数），越来越多的宠主在满足幼猫基本营养需求的同时开始关心幼猫的抵抗力问题。当幼猫抵抗力下降时，会出现精神萎靡、消瘦、毛发干枯、容易生病等症状，严重影响幼猫的生长发育。新生幼猫从母猫乳汁中获得免疫球蛋白，从而获得免疫力。但一般在几周后，这种免疫力便开始逐渐下降。此时除了给幼猫定期驱虫和接种疫苗外，还可通过在日粮中添加特定的营养素，辅助提高幼猫的免疫力和抵抗力，使幼猫健康生长发育。此前已有研究证实，黑水虻和螺旋藻的免疫调节和抗氧化作用，并已被应用到畜禽养殖中（张金金等，2021；韦金河等，2009），但在幼猫饲养中的应用还鲜见报道。在本研究中，试验结果表明通过在日粮中添加黑水虻和螺旋藻可提高幼猫的免疫力和抗氧化能力，从而提高幼猫的抵抗力。

研究表明，将黑水虻和螺旋藻作为营养性饲料添加剂应用到畜禽养殖中，可以提高畜禽生产性能、增强机体免疫功能和提高抗氧化能力，从而提高抗病力（刘彬等，2023；张金金等，2021；林春榕等，2013；万顺康等，2013）。本试验结果表明，T组的平均日增重及平均日采食量最高，说明相较于其他两组，T 组的生长性能最好。 IgA、IgG 和IgM 这三种免疫球蛋白是参与体液免疫的主要抗体，通过检测它们在血清中的含量可了解幼猫机体合成免疫球蛋白的功能及机体抗感染免疫能力，代表机体的体液免疫水平。 IL-6 和IL-2 作为促进T、B 细胞增殖分化的细胞生长因子，对免疫功能的调节具有重要影响。 TNF-α 是由单核-巨噬细胞合成和释放的多功能细胞因子，参与免疫系统功能的调节，在许多重要的生理和病理活动中起关键作用（余伟明等，1991）。本研究发现，日粮中添加黑水虻和螺旋藻可促进血清IgA、IgM 水平升高，并在显著升高IL-2 和IL-6 水平的同时抑制了TNF-α 的表达。除此之外，猫三联疫苗的抗体水平结果也从侧面反映出了它们提高了这些抗体在幼猫体内的滴度，增强幼猫在面对这三种常见传染病病毒时的抵抗力。

血液代谢物的变化能够实时反映动物的代谢状况、营养水平和健康情况，与传统的血液生化指标相比，代谢组学能更加系统地反映机体的生理健康状况，更利于指导和预防某些营养代谢病（李胤豪等，2022）。茶皂醇A 由茶皂素水解得来，研究表明茶皂素能促进畜禽生长发育，提高血液中的免疫因子水平，增强机体免疫能力（王留幸等，2022；常肖肖等，2017；常肖肖等，2016）。熊果酸具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等功效，能有效地清除自由基，具有很好的抗氧化能力（霍明洋等，2022）。在本试验中，T 组代谢物中的茶皂醇A 和熊果酸水平显著上调（p ＜0.05），说明日粮中添加黑水虻和螺旋藻能增强幼猫的免疫力和提高抗氧化水平。

氧化应激的特点是内源性抗氧化防御功能降低，无法抵抗活性氧（ROS）的过度产生（Lushchak，2014）。当它过度生成时会对包括免疫细胞在内的所有细胞造成严重毒害，并导致脂质、蛋白质和DNA 受损（Freeman 等，1982）。体内氧化应激水平可以通过多种生物标志物来测量，如MDA、SOD、T-AOC 等。 MDA 是体内ROS 自由基反应的终产物，其被认为是评估脂质氧化损伤的最敏感标记之一（Frijhoff 等，2015）。通过测定MDA 的含量，可间接反映出机体细胞受自由基攻击后的受损程度。 SOD 是体内最重要的抗氧化酶类之一，能把有害的超氧化自由基转化为过氧化氢，随后CAT 将过氧化氢分解为完全无害的水（张玉栋等，2020；林春榕等，2013），为机体提供抗氧化防御机理。T-AOC 是指各种抗氧化物质和抗氧化酶等总的抗氧化水平，其反映了生物活性物质的抗氧化能力（Wang 等，2012）。本试验结果表明，日粮中添加黑水虻和螺旋藻可使SOD 活性和T-AOC 能力显著提高，并抑制MDA 的生成，说明它们具有清除自由基、保护幼猫免受氧化损伤的能力。