仔猪腹泻病综合防控技术探讨

魏 杰

（江苏省徐州市动物疫病预防控制中心，江苏 徐州 221006）

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDⅤ）引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，发病猪常常以水样腹泻、呕吐、精神沉郁和食欲下降为主要症状[1]。各种年龄的猪均易感，仔猪病死率可达90%以上[2]。我国在1973 年就分离到PEDⅤ（经典毒株）。近年来，PED 持续发生和流行对养猪业的发展造成重大影响，一些规模化猪场因集约化的发展模式，PEDⅤ暴发所造成的经济损失更为惨重[3]。

1 猪流行性腹泻疫情发生、流行的成因

经研究，猪流行性腹泻病毒变异株是疫情发生、流行的元凶。猪流行性腹泻病毒变异株与原来的PEDⅤ毒株（经典毒株）的基因组同源性在97%左右，变异最大的为S 基因，同源性在94%以下，且存在氨基酸发生缺失和插入的序列特征。由于PEDⅤ变异株在基因组上的高度变异导致其致病性和免疫原性发生重大改变，使该病在PEDⅤ疫苗免疫的猪群中也不断发生，给养猪业造成了严重的经济损失。

2 仔猪腹泻病流行病学调查

2.1 开展猪场饲养管理情况调查

通过对全市15 个养殖猪场（户）近些年仔猪腹泻病调查，该病发病率在15.7%～33%之间，死亡率在21.2%～42.5%之间。规模越大的猪场，仔猪腹泻病率发生率越低，规模越小的猪场，仔猪的腹泻病越严重。接种猪传染性胃肠炎疫苗（T疫苗）和猪流行性腹泻疫苗（P 疫苗）能明显降低仔猪腹泻发病率和死亡率。

通过调查，仔猪腹泻病多流行于寒冷季节。仔猪腹泻发病率以母猪存栏50 头以下的最高，母猪存栏100 头以上的相对较低，尤其是小于10日龄的仔猪，死亡率可达100%。其主要原因多为小型猪场或散户设施设备简陋，饲养管理不规范，防疫条件比较薄弱，猪场卫生环境差等多种因素造成。

2.2 开展多病原感染情况调查

对不同日龄、不同猪场的猪粪样进行了多病原的检测，其中猪流行性腹泻病毒阳性率为37.7%；TGEⅤ阳性率仅为0.53%；轮状病毒阳性率为5.46%；脊病毒阳性率最高，为98.11%；PEDⅤ和脊病毒混合感染阳性率高达66.04%；其他病原的混合感染也都在7%以上，结果表明PEDⅤ是引起仔猪腹泻的主要病原，而且非常容易和其他病原发生混合感染。

3 仔猪腹泻病检测技术研发

3.1 猪流行性腹泻病毒变异株RT-PCR 试剂盒研发

根据变异株S 基因变异的特点设计引物，只能扩增变异株，可以区分经典毒株，扩增后制备阳性质粒，以阳性重组质粒为模板进行了各种条件的摸索，优化了引物浓度及混合液的配比，确定了RT-PCR 一步法扩增的条件。通过倍比稀释模板，确定了RT-PCR 检测的敏感性为100 拷贝/μL。用所组装的试剂盒对30 份猪流行性腹泻病毒阳性组织样品以及30 份猪流行性腹泻病毒阴性样品分别重复检测3 次。结果表明，重复的三次结果一致，初步表明试验所组装的检测试剂盒具有良好的重复性。试剂盒的保存期试验：-20 ℃度保存8 个月，检测其敏感性、特异性均未改变。

3.2 双抗体夹心ELⅠSA 抗原定量-检测技术研发

为了能够对临床样品中的PEDⅤ进行抗原定量，对病毒的N 蛋白进行了表达，制备了单克隆抗体，建立了双抗体夹心ELⅠSA 方法，以已知浓度的N 蛋白作为标准品，可以对临床病料中的PEDⅤ进行抗原定量检测，该试剂盒敏感性较好，最低能检测1 ppb 蛋白，可以实现高通量、定量检测抗原的目的，同时还可以检测疫苗中的有效抗原含量，为PEDⅤ的定量检测和疫苗评估提供了有力的工具。

3.3 PEDⅤ超敏感胶体金快速检测技术研发

对临床上流行的PEDⅤ变异毒株的N 蛋白进行了表达，制备了30 株单克隆抗体，对抗体进行配对筛选和条件优化，建立了胶体金快速抗原检测试纸条，该试纸条最低检测灵敏度可达10-4TCⅠD50，比韩国进口试纸条敏感10 倍，成本低廉，且检测时间只需要15 min，不需要任何检测仪器，肉眼即可判断结果，非常适用于基层临床检测，能够简便、快速地对PEDⅤ进行检测与诊断。

4 开展猪流行性腹泻病毒疫苗开发和免疫技术研究

4.1 开展猪流行性腹泻病毒变异株和猪传染性胃肠炎二联细胞灭活苗研究

4.1.1 毒株的克隆纯化与高滴度筛选 通过3 次空斑纯化、克隆筛选到了高滴度的猪流行性腹泻病毒变异株（107.5TCⅠD50/mL）和猪传染性胃肠炎病毒（108.5TCⅠD50/mL）。

4.1.2 疫苗灭活方式的选择 分别用甲醛和二氧化氢灭活病毒，氢氧化铝为佐剂，检测不同灭活方式的疫苗免疫效果。实验结果显示：用甲醛灭活病毒制备的疫苗保护率为2/3；二氧化氢灭活制备的疫苗保护率为1/3。

4.1.3 疫苗佐剂的选择及免疫效力试验 分别选取了4 种水佐剂（AD1、AD2、AD3、铝）、2 种油佐剂（HⅤ、H45）制备灭活疫苗，分别从主动免疫和被动免疫两个方面比较了各种疫苗的免疫效力。

主动免疫：AD1 佐剂组和AD3 佐剂组抗体水平最高，在免疫3 周后，抗体开始上升，第7周达到最高。被动免疫：于母猪分娩前1 个月免疫，对产后5 日龄仔猪进行抗体检测和攻毒。AD1 佐剂组和AD3 佐剂组具有较好的免疫效力，攻毒保护率分别达到80%和70%。

与同类产品的比较试验：于母猪分娩前1 个月免疫本实验的两组疫苗和市场上所售的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联灭活苗，对产后5日龄仔猪进行抗体检测和攻毒。结果显示，AD1佐剂组保护率最高，可达到80%；AD3 佐剂组和在售疫苗免疫效力相当，中和抗体水平在1:35 左右，攻毒保护效果较差，TGEⅤ和PEDⅤ攻毒全部发病。

4.1.4 安全性试验 将疫苗一次单剂量、单剂量重复和一次超剂量分别接种3～5 日龄仔猪和怀孕母猪测定其体温变化、临床症状，观察接种部位、母猪的产仔情况等。免疫后28 d，剖杀免疫组和对照组，观察接种部位变化。结果显示免疫后母猪各方面指标正常，无不良反应，表明该疫苗对母猪和仔猪均是安全的。

4.2 猪流行性腹泻病毒弱毒株培育技术

对分离的猪流行性腹泻病毒AH2012/12 在Ⅴero 细胞上连续传代130 代，分别对第1、20、60、90、130 代代毒株进行了致病性试验及S 基因的序列分析比较。结果显示，第1 代、第20代攻毒后仔猪全部发生腹泻，发病率为100%。第60 代攻毒后致病性减弱，第90 代病毒无致病性，全部不发病，表明病毒已经被弱化。S 基因的序列比对发现，从第90 代开始，出现了特征性的氨基酸突变，突变为经典弱毒株的特征，表明毒株被有效致弱，可以作为弱毒疫苗株，且遗传较为稳定。

4.3 开展酵母细胞壁免疫多糖配伍T-P 二联苗免疫效果试验

酵母细胞壁免疫多糖具有免疫佐剂功能，能够提高抗体效价，提高巨噬细胞对许多病原，如病毒、细菌、真菌和寄生虫的抵抗能力，进而改善机体免疫系统对外源病原入侵的抵抗力。这也通过实验得到了证明（表1），试验一组采用T-P二联苗后海穴接种免疫，试验二组采用T-P 二联苗免疫同时使用酵母细胞壁免疫多糖，对照组未免疫也未使用酵母细胞壁免疫多糖。与对照组相比，试验一组仔猪出栏率和抗体水平分别提高10.9%和 240%，发病率和死亡率分别降低70.99%和74.5%；试验2 组与试验1 组相比，仔猪出栏率和抗体水平分别提高0.35%和11.76%，发病率和死亡率分别降低29.2%和58.22%；且试验二组仔猪整体状态表现为精神状态良好，粪便成型，皮毛光滑，明显优于试验一组。

表1 T、P 二联疫苗免疫和免疫多糖应用效果

4.4 自制疫苗

根据猪场要求，采集发病症状比较典型的仔猪小肠，经过研磨、匀浆、过滤和灭活等程序，制造出针对该猪场毒株的组织灭活疫苗进行紧急免疫[2]。

4.5 优化免疫程序

根据我市及周边地区生猪疫病流行特点，进一步优化免疫程序，制定出适合本地生猪养殖业的科学合理的免疫程序并推广。生猪发病率显著降低，抗生素药物使用明显减少。

5 完善各项饲养管理措施

5.1 环境控制

哺乳仔猪猪舍环境温度控制为25～30 ℃，猪舍的湿度一般控制在50%～70%。要经常通风换气，保持舍内空气新鲜。冬季可适当提高饲养密度保暖，夏季可降低饲养密度降温。饲养密度应为0.8～1.0 m2/头，每圈10～15 头为宜。

5.2 断奶仔猪培育技术

目前，多数猪场将4～5 周龄断奶仔猪投入肉猪生产场进入育肥阶段饲养。但由于受饲料和环境因素的影响，很容易发生以断奶腹泻为主要特征的断奶综合症。主要表现仔猪腹泻、水肿，采食量降低、消瘦，被毛粗乱，皮肤苍白，抵抗力下降。这主要是由于断奶仔猪消化机能较弱，抗逆性差，免疫机制不健全等生理、环境、营养因素而造成的。因此，做好断奶仔猪各项保育措施（表2），安全度过保育期十分重要。

表2 断奶仔猪保育阶段管理措施

5.3 建立小单元化饲养和全进全出制度

小单元化饲养全进全出有利于猪场疫病防控，提高猪场的生产水平。从分娩、保育到育成育肥采用“全进全出”的饲养方式，并将保育期分为保育前期（3 周）和保育后期（2 周），做到同一栋猪舍的猪群同时全部转出，配种舍和怀孕舍也应采取全进全出生产模式。

6 小结

通过对发病猪场开展仔猪腹泻病流行病学调查，检测出造成腹泻病的主要病原，筛选建立生猪腹泻病病原快速检测方法，制定相关快速诊断检测技术规程，研发出猪腹泻病疫苗，开展酵母细胞壁免疫多糖配伍T-P 二联苗免疫效果等试验，进一步优化免疫程序，建立示范场开展仔猪腹泻病综合防控试验等一系列疫病防控措施，逐步推广仔猪腹泻病综合防控技术，使仔猪腹泻病发病率、死亡率均有所下降，提高了广大生猪养殖场生产效率和经济效益。