鸡circ_DNAJC3的鉴定及功能预测

李欢，安凯，孙长花，孙红艳

（1.扬州市职业大学生物与化工工程学院，江苏 扬州 225009；2.扬州市农产品智能测控与清洁生产工程技术研究中心，江苏 扬州 225009；3.江阴市富仁高科股份有限公司南京分公司，南京 210012；4.扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009）

近年来研究学者发现circRNA并非转录噪声，而是一种新型的、几乎没有蛋白质编码能力的非编码RNA，可在多种生物学过程中发挥调控作用[1]。其特点是在RNA发生剪切后，外显子5′端的受体剪接位点和下游外显子3′端的供体位点连接，形成共价闭环的稳定结构，不易被RNA酶降解[2]。目前多项研究表明circRNA在家禽生长发育、繁殖以及疾病中均发挥着重要作用[3-4]。例如，Yu H.L.等发现circRNA4338能够协同VPREB3和CXCL13L3参与柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）感染过程中的免疫反应[3]。Chen L.等的研究表明过表达或敲低circ_EZH2分别显著性抑制或促进新城疫病毒（Newcastle disease virus）的复制，参与免疫应答过程[4]。

我们前期转录组测序发现在伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhymurium）衍生的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）感染前后circ_DNAJC3的表达量极显著性降低，表明此circRNA在细菌感染中可能发挥重要的作用。环状circ_DNAJC3的源基因为DNAJC3，位于鸡1号染色体上。DNAJC3是DNAJ热休克蛋白家族（Hsp40）的成员，参与蛋白质的折叠和组装；并可作为分子伴侣激活HSP70的ATPase活性[5]。Kuo Y.等发现DnaJ具有抑制果蝇中错误折叠蛋白质的聚集和毒性[6]。J.Hageman等证明DnaJs在非洲爪蟾中可以保护细胞免受由错误折叠的蛋白质毒性引起的损伤[7]。此外，DNAJC3也参与细胞凋亡，降解损失蛋白，对细胞生存至关重要。

巨噬细胞是家禽重要的免疫细胞，是抵御各种细菌感染的第一道防线。在畜牧兽医研究领域，鸡巨噬细胞HD11是一种永生细胞系，广泛应用于病原微生物、宿主免疫以及微生物与宿主相互作用机制的研究。本研究以鸡巨噬细胞HD11为研究材料，通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、Sanger测序、亚细胞定位、RT-qPCR以及生物信息学软件鉴定circ_DNAJC3是否存在、解析其在细胞中的位置和在各组织中的表达水平，并预测其功能和潜在作用方式，为进一步研究circ_DNAJC3在细胞生物学过程（特别是细菌感染过程）中的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

鸡巨噬细胞HD11来自于扬州大学动物科学与技术学院动物遗传实验室。Trizol试剂盒购自美国Life Technologies；TIANamp基因组DNA提取试剂盒购自中国北京天根生物试剂公司；反转录试剂盒SYBR PrimeScript PLUS RTRNA PCR Kit购自中国大连的Takara；RNase R购自瑞典的Epicenter公司；RT-qPCR定量试剂盒SYBR Premix Ex Taq Ⅱ kit购自中国大连的Takara；琼脂糖购自美国的Bio-Rad；PBS和DMEM购自美国的Hyclone；胎牛血清购自美国的GIBICO。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计

根据鸡DNAJC3基因（基因ID: 418787）和鸡circ_DNAJC3的序列，利用Primer 5.0软件设计circ_DNAJC3的发散型引物和DNAJC3的收敛型引物。引物序列见表1。

表1 环状RNA和基因的引物序列Table 1 Primer sequence for circRNAs and genes

1.2.2 细胞培养

鸡巨噬细胞在添加10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养。培养箱温度为37 ℃，湿度为60%～70%，二氧化碳浓度为5%。

1.2.3 总RNA和基因组DNA的提取和质量控制

当细胞汇合度达到80%～90%时，收集鸡巨噬细胞。利用TRIzol试剂盒提取巨噬细胞的总RNA。利用基因组DNA试剂盒提取基因组DNA（gDNA）。利用Nanodrop ND-1000分光光度计分别检测提取的RNA或DNA的质量和浓度。A260/280比值大于2代表RNA质量合格。A260/280的比值在1.8时代表DNA质量合格。

1.2.4 鸡circ_DNAJC3环状结构的检测

将1.2.3中获得的质量合格的RNA反转录为cDNA，并以此为模板，利用circ_DNAJC3的发散型和DNAJC3的收敛型引物进行PCR反应。同时，以1.2.3中获得的质量合格的基因组DNA（gDNA）为模板，利用circ_DNAJC3的发散型和DNAJC3收敛型引物进行PCR反应。将获得的PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定circ_DNAJC3的环状结构。

1.2.5 RNase R消化

在37 ℃下，利用3 U/μg RNase R消化1.2.3中获得的质量合格的总RNA（2 μg）30 min。随后，将总RNA置于70 ℃下继续消化10 min。利用反转录试剂盒将RNase R处理前后的总RNA分别反转录成cDNA。并以此为模板，进行RT-qPCR试验，检测circ_DNAJC3和其源基因DNAJC3的表达水平。同时，扩增产物送上海生工（中国上海）进行测序。

1.2.6 核质分离实验

根据NE-PER细胞核和细胞质提取试剂盒说明书，分离鸡巨噬细胞的细胞核和细胞质。利用TRIzol试剂盒分别从细胞核和细胞质中提取其总RNA。对分离的总RNA进行RT-qPCR试验以分别检测circ_DNAJC3在细胞核和细胞质中的表达水平。RT-qPCR试验具体步骤见1.2.8。

1.2.7 不同组织的总RNA的提取

采集6只成年三黄鸡（公鸡）的心脏、十二指肠、脾脏、腿肌、大脑、小脑、回肠、肺脏、胃脏、下丘脑、哈德氏腺、肝脏、胸腺及盲肠组织后保存于液氮中。利用TRIzol试剂盒分别提取上述不同组织的总RNA。总RNA的质量检测方法和标准同1.2.3。将质量合格的总RNA反转录成cDNA，以此为模板开展RT-qPCR试验来检测circ_DNAJC3在不同组织中的表达水平。RT-qPCR试验具体步骤见1.2.8。

1.2.8 RT-qPCR试验

来自1.2.5、1.2.6和1.2.7中质量合格的总RNA分别通过反转录试剂盒SYBR PrimeScript PLUS RTRNA PCR反转录成cDNA后，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒进行RT-qPCR试验。RT-qPCR试验的循环条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；40个循环。选择GAPDH基因作为内参基因。使用2-ΔΔCt方法对RTqPCR数据进行统计分析，每个样本有3个单独的重复。

1.2.9 生物信息学分析

利用NCBI数据库中的ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）来检测circ_DNAJC3是否具有开放阅读框（ORF）及编码潜能。利用RNAfold WebServer（http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWeb-Suite/RNAfold.cgi）预测circ_DNAJC3的二级结构。利用circAtlas（https://ngdc.cncb.ac.cn/circatlas/）预测circ_DNAJC3的RNA结合蛋白。利用软件miRanda（http://cbio.mskcc.org/microrna_data/miRandaaug2010.tar.gz）来预测circ_DNAJC3可能互作的miRNAs，以及这些预测的miRNAs的靶基因。进一步用在线软件DAVID（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）对预测的靶基因进行GO和KEGG分析。

1.2.10 统计分析

所有数据均以平均值±标准差表示。采用t检验或单因素方差分析并进行多重比较。使用JMP统计软件（Version 15.2.1, SAS Institute）进行统计分析。P<0.05时表示差异具有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 鸡circ_DNAJC3环状结构的鉴定

前期我们对LPS感染前后的鸡肺脏进行RNAseq，结果显示circ_DNAJC3的表达水平显著性降低（图1A）。Circ_DNAJC3来源于1号染色体上鸡DnaJ热休克蛋白家族（Hsp40）成员C3（DNAJC3）基因的外显子2至4（图1B）。为了检测circ_DNAJC3是否具有环状结构，我们根据其序列构建了一对发散型（背靠背设计circ_DNAJC3的引物）和收敛型（正常设计DNAJC3的引物）引物。结果显示以cDNA为模板进行PCR扩增时，circ_DNAJC3和其源基因DNAJC3以及GAPDH的引物均能扩增出条带；而circ_GAPDH的引物不能扩增出条带（图2A）。以gDNA为模板时，circ_DNAJC3和circ_GAPDH的引物均不能扩增出条带，而源基因DNAJC3和GAPDH的引物可以扩增出条带（图2B）。以上结果表明circ_DNAJC3存在环状结构。

图1 鸡circ_DNAJC3的基本信息Figure 1 The basic information of chicken circ_DNAJC3

图2 鸡circ_DNAJC3的鉴定Figure 2 Identification of chicken circ_DNAJC3

3.2 鸡circ_DNAJC3的稳定性检测

为进一步验证circ_DNAJC3的稳定性，我们利用RT-qPCR来检测以RNase R处理前后的总RNA为模板时circ_DNAJC3和DNAJC3的表达水平。结果显示circ_DNAJC3的表达水平在RNase R处理前后无显著性差异（图3A）。而其源基因DNAJC3的表达水平在RNase R消化后发生显著性下降（图3A）。同时，Sanger测序结果显示circ_DNAJC3的产物序列正确，存在环化位点GG（图3B）。以上结果表明circ_DNAJC3具有稳定的环状结构。

图3 鸡circ_DNAJC3的稳定性检测Figure 3 The stability identification of chicken circ_DNAJC3

3.3 鸡circ_DNAJC3的亚细胞定位

利用NE-PER试剂盒分离鸡巨噬细胞的细胞核和细胞质后，提取相应的总RNA用于后续RTqPCR试验以检测circ_DNAJC3在细胞质和细胞核中的表达水平。结果显示鸡circ_DNAJC3在细胞质中显著性富集（图4）。

图4 鸡circ_DNAJC3的亚细胞定位Figure 4 Subcellular localization of chicken circ_DNAJC3

图5 Circ_DNAJC3的二级结构预测Figure 5 Prediction of the secondary structure of circ_DNAJC3

3.4 Circ_DNAJC3的二级结构预测

RNA结构的确定对于理解其功能、结构-功能关系以及设计靶向RNA的治疗和诊断非常重要。自由能最小化是阐明RNA二级结构的重要工具，它可以帮助确定比较序列分析模型，或者建议通过定点诱变或其他方法测试可能的结构。因此，我们利用在线分析软件RNAfold WebServer预测了circ_DNAJC3二级结构的最小自由能。结果显示circ_DNAJC3二级结构的最小自由能为-67.00 kcal/mol。RNA分子结构的稳定是由于碱基配对造成了能量的降低。因此，circ_DNAJC3的自由能显示其二级结构较为稳定。

3.5 Circ_DNAJC3在不同物种中的保守性检测

为确定circ_DNAJC3在不同物种中是否广泛存在及其保守性，我们分别比对了circ_DNAJC3在人（Has，human）、大鼠（Rno，rat）、小鼠（Mmu，mouse）、猪（Ssc，pig）、牛（Bta，cattle）和鸡（Gga, chicken）中的同源性。结果显示circ_DNAJC3在上述6个物种中的序列长度为236～311 bp（表2）。其中人circ_DNAJC3的序列与鸡的同源性最高，为80.39%；而猪circ_DNAJC3的序列与鸡的同源性最低，为58.84%（表2）。

表2 不同物种的circ_DNAJC3序列信息Table 2 The information of circ_DNAJC3 sequence of different species

3.6 Circ_DNAJC3互作RNA结合蛋白（RBP）的预测

RBP是一类通过介导RNA成熟、转运、定位和翻译，与RNA代谢过程相关的蛋白质。RBP在circRNA的生命周期中起着不可或缺的作用，二者的互作是双向的，即RBP可以调控circRNA，circRNA也可以调节RBP。因此，我们对circ_DNAJC3互作的RBP进行了预测。结果显示AGO2和circ_DNAJC3的结合位点最多（N=287），其次为CELF2、PTBP1和HNRNPC（表3）。

表3 Circ_DNAJC3互作RNA结合蛋白（RBP）的预测Table 3 Prediction of circ_DNAJC3 interacting with RNA Binding Protein (RBP)

3.7 鸡circ_DNAJC3在不同组织中的表达谱

为检测鸡circ_DNAJC3在不同组织中的表达规律，我们采集心脏、十二指肠、脾脏、腿肌、大脑、小脑、回肠、肺脏、胃脏、下丘脑、哈德氏腺、肝脏、胸腺及盲肠组织，提取其总RNA，并反转录为cDNA，以此为RT-qPCR试验的模板。结果显示以circ_DNAJC3在心脏中的表达为基准时，circ_DNAJC3在回肠、胸腺、脾脏、盲肠、胃脏、肺脏、肝脏和哈德林腺体中具有较高的表达量（P<0.01）；而其在下丘脑、大脑、小脑和十二指肠中表达量较低（图6）。

图6 鸡circ_DNAJC3在不同组织中的表达规律Figure 6 The expression pattern of circ_DNAJC3 in chicken different tissues

3.8 Circ_DNAJC3的编码潜力

Circ_DNAJC3是一种保守的环状RNA，来源于其源基因DNAJC3的外显子2至4形成共价闭环结构。我们通过ORFfinder网站检测不同物种的circ_DNAJC3开放阅读框（ORF）来预测其编码潜能。如表4所示，鸡circ_DNAJC3的ORF起始于45 bp，终止于311 bp，其长度为267 bp；其可能编码的氨基酸（aa）长度为88。在猪中，我们预测circ_DNAJC3不具有编码潜力。在人、大鼠、小鼠和牛中，circ_DNAJC3可能具有编码能力，其编码的aa的同源性与鸡比偏低（<50%）。以上预测结果表明鸡、人、大鼠、小鼠和牛中，circ_DNAJC3可能具有编码潜力。

表4 不同物种中circ_DNAJC3的开放阅读框（ORF）信息Table 4 The open reading frame (ORF) information of circ_DNAJC3

3.9 构建circ_DNAJC3-miRNA-mRNA网络

为进一步解析鸡circDNAJC3的调控网络，我们利用miRanda来预测可能与circ_DNAJC3相互作用的miRNA和mRNA。结果显示，鸡circ_DNAJC3环状结构可结合已知miRNA，gga-miR-132b-5p。同时，我们预测gga-miR-132b-5p可能有33个靶基因（图7）。KEGG结果显示这些靶基因在钙离子信号通路（calcium signaling pathway）中显著性富集。

图7 与circDNAJC3相互作用的gga-miR-132b-5p及其可能的靶基因Figure 7 The potential target genes of gga-miR-132b-5p that can interact with circDNAJC3

4 讨论

鸡巨噬细胞的免疫过程是一个极其复杂的生物过程，不仅受到遗传因素的影响，还受到表观遗传修饰的作用[8-10]。表观遗传修饰包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化以及非编码RNA等。目前，在人类（Homo sapiens）、小鼠（Mus muculus）和猪（Sus scrofa）等物种的各种免疫组织或细胞中已经鉴定出许多circRNAs[11-13]。例如，Zhu X.Y.等发现circHIPK3能够参与T细胞活化和增殖的调节[14]。我们前期的RNAseq试验显示circ_DNAJC3在LPS感染前后表达水平显著性降低。因此，本研究我们旨在进一步鉴定circ_DNAJC3是否真实存在，并通过生物信息学软件分析其潜在作用机制。

大量研究结果显示多数circRNAs主要由外显子反向剪接组成共价闭合的环状结构，在物种间具有保守性，比线性RNA更稳定，其表达在组织和发育过程中表现出特异性[15-17]。本研究通过PCR扩增、Sanger测序以及RNase R消化确定鸡circ_DNAJC3存在稳定的环状结构。同时，除了猪之外，circ_DNAJC3在其他物种中相对比较保守。Zhang X.M.等在蜜蜂中发现DNAJC3在肌肉和表皮中高表达[18]。本研究显示circ_DNAJC3在回肠、胸腺、脾脏、盲肠、胃脏、肺脏、肝脏和哈德林腺体中高表达，表明此circRNA可能在免疫组织中发挥重要作用。亚细胞定位显示鸡circ_DNAJC3位于细胞质中，可能与源基因DNAJC3有相似的功能。

近来越来越多的研究表明circRNA可作为分子海绵竞争性吸附miRNA，进而参与免疫反应[19-21]。例如，circ_DCLRE1C能够调节鸡巨噬细胞中的miR-214b-3p/STAT3通路，以进一步调节脂多糖诱导的炎症反应和细胞凋亡[22]。本研究显示鸡circ_DNAJC3可能与gga-miR-132b-5p发生相互作用。我们预测gga-miR-132b-5p的靶基因在钙离子信号通路（calcium signaling pathway）中显著性富集，参与细胞增殖、分化、凋亡及代谢。

5 结论

本研究显示在鸡巨噬细胞中，circ_DNAJC3主要存在于细胞质中，是一种稳定、保守的环状RNA，主要在回肠、胸腺、脾脏、盲肠、胃脏、肺脏、肝脏和哈德氏腺中高表达。通过生物信息学软件分析发现鸡circ_DNAJC3可能互作的RNA结合蛋白为AGO2、CELF2、PTBP1和HNRNPC；并可能与ggamiR-132b-5p发生相互作用，进而通过钙离子信号通路参与调节细胞增殖、分化、凋亡及代谢。